Enhancer Composition and Dosage Control Developmental Gene Expression at the Ihh Locus

Abstract

Developmental genes, like Indian hedgehog (IHH), are commonly regulated by a cluster of enhancers that display redundancy in reporter assays and transcription factor binding sites, properties that are thought to provide developmental robustness. Copy number variations (CNVs) of the non-coding genome often comprise cis-regulatory elements such as enhancers and have been reported to be a frequent cause of human disease. Thus, raising the question of how redundancy and dosage respond to systematic variations affecting the number and composition of enhancers within a cluster. In this study, these questions were addressed in an exemplary manner at the IHH locus where variable duplications have been associated with highly localized phenotypes, i.e. craniosynostosis, syndactyly and polydactyly. The functional and structural organization of the murine Ihh locus was investigated by 4C-Seq analyses in combination with enhancer trap reporter assays. 4C-Seq revealed a limited spread of interaction of the Ihh promoter within a surrounding of 250kb, being most prominent in the intron of its upstream neighboring gene Nhej1. In comparison with publicly available expression data of Ihh neighboring genes, the enhancer-trap assay revealed Ihh-specific reporter activation exclusively, suggesting that Ihh builds an isolated regulatory sub- domain (Ihh-TAD) that is populated by Ihh-specific regulatory elements. The combined analysis of 4C-Seq data with publicly available enhancer-associated histone marks, Ihh-specific transcription factor binding sites and sequence conservation identified a set of nine putative enhancers. Enhancer-reporter assays confirmed the in vivo activity of all nine enhancers, and further revealed that these elements function in complex manner as they displayed only partial redundancy but also individual specificity among the scored tissues. To address the functionality of the enhancer cluster and the effects of enhancer dosage on Ihh expression, CRISVar was applied to induce deletions and duplications. The in vivo functionality of the Ihh-TAD was confirmed by deleting the full Nhej1-intron that contained eight of the nine identified enhancers. Further, consecutive deletions of the enhancer cluster revealed that the enhancers function in an additive manner, resulting in tissue- specific impairments of Ihh expression and skeletal development. By duplicating parts of the enhancer clusters the human malformations were successfully reconstructed in the mouse models. However, not all duplication lines recapitulated the disease features completely, suggesting divergency among the underlying pathomechanisms. Further analysis revealed that cransiosynostosis was induced by a local upregulation of Ihh expression in the skull cap, which correlated with the number of skull-specific Ihh enhancers, suggesting a dosage effect. In contrast, the limb phenotypes did not relate with increased Ihh expression. In syndactyly mutants, ectopic activation of the IHH pathway was observed in the fingertips and the distal interdigital mesenchyme of E13.5 limbs. The expanded IHH signaling precisely overlapped with a local loss of apoptosis in this region, but did not interfere with the signaling pathways that are induced during digit separation, suggesting that a local misexpression of Ihh might be sufficient to induce syndactyly. 4C-Seq analyses revealed that this misexpression was most likely caused by the rearrangement of the enhancer cluster, resulting in a unique spatial and regulatory configuration at the boarder of the duplication. This study shows that spatio-temporal precision of gene expression is controlled by the complexity of multipartite enhancer clusters and that alterations in dosage and composition of individual enhancer elements of these clusters affect the precision of gene expression that can result in disease.

Die Expression von Genen, die wie Indian Hedgehog (IHH) bei der embryonalen Entwicklung eine Schlüsselrolle spielen, werden für gewöhnlich durch mehrere Enhancer reguliert, die sich in Form von Enhancer-Clustern organisieren. Die Enhancer eines Clusters weisen eine gewisse Redundanz in Reporter-Assays und Transkriptionsfaktor-bindestellen auf, um eine stabile sowie präzise Expression des Zielgens gewährleisten zu können. Veränderungen in der Kopienzahl (CNVs) nichtkodierender genomischer Sequenzen betreffen meist cis- regulatorische Elemente, wie beispielsweise Enhancer. CNVs können vom Genom toleriert werden aber auch zu schweren Krankheitsbildern, wie zum Beispiel Craniosynostose, Syndactylie und Polydaktylie, die durch Duplikationen am IHH Lokus verursacht wurden, führen. Daraus ergibt sich die Frage, inwieweit systemische Variationen innerhalb eines Enhancer-Clusters, also Veränderungen in der Anzahl und Komposition einzelner Enhancer-Elemente, durch die redundanten Eigenschaften der übrigen Komponenten ausgeglichen werden können. Um diese Frage zu klären, wurde die Regulation der Genexpression am Ihh Lokus während der Knochenentwicklung mit Hilfe von genetisch veränderten Mausmodellen untersucht. Durch eine vergleichende Analyse mit Circular Chromatin Conformation Capture (4C-Seq) und Enhancer-trap Assays konnte die regulatorische Domäne von Ihh bestimmt werden. Diese befindet sich hauptsächlich stromaufwärts von Ihh, in dem dritten Intron des Nachbargens Nhej1. Der Vergleich, des aus dem Enhancer-trap hervorgehenden Expressionsmusters mit öffentlich zugänglichen Expressiondaten der umliegenden Gene, zeigte, dass die Aktivität dieser regulatorischen Region isoliert agiert. Um einzelne Elemente des Enhancer-Cluster bestimmen zu können, wurden die 4C-Seq Daten sowie Enhancer-assoziierte Histonmarkierungen, Sequenzkonservierung und Ihh-typische Transkriptionsfaktorbindestellen analysiert. Insgesamt konnten so neun Enhancer identifiziert werden, deren in vivo Aktivität in den folgenden Enhancer-Reporter Assays bestätigt wurde. Entgegen der bislang gängigen Annahme, dass Enhancer redundante Eigenschaften aufweisen, konnte mit Hilfe eines Scoring-Systems gezeigt werden, dass die neun Enhancer vorrangig gewebe-spezifisch agieren. Die Funktionalität des Enhancer-Clusters konnte durch die Deletion des gesamten Nhej1-introns, welches acht der neun Enhancer beinhaltet, nachgewiesen werden. Homozygote Tiere dieser Linie zeigten starke Einschränkungen in der Skelettentwicklung, ähnlich dem bereits publizierten Ihh knockout Mausmodel. Die Auswirkungen von veränderter Enhancer-Anzahl und -komposition innerhalb des Clusters wurden mithilfe systematischer Deletionen und Duplikation, die mit der CRISVar Technologie generiert wurden, untersucht. Die systematische Verminderung der Enhancer-Anzahl zeigte eine kontinuierliche Abnahme der Ihh-Expression in den jeweiligen Zielgeweben und einen damit einhergehenden verstärkten gewebespezifischen Phänotyp. Durch die Rekonstruktion der humanen Duplikationen, sowie durch die Duplikation des gesamten Enhancer-Clusters, konnten die Krankheitsbilder der Patienten im Mausmodell exakt nachgestellt werden. Expressionanalysen zeigten, dass die Entwicklung von Craniosynostose vermutlich durch einen sogenannten ‚Dosage-Effekt’, also eine lokal verstärke Expression von Ihh, hervorgerufen durch die erhöhte Anzahl der Schädel- spezifischen Enhancer, induziert wurde. Die Entwicklung von Syndactyly hingegen wurde ausschließlich in einer der drei Duplikationslinien beobachtet und konnte nicht mit einer erhöhten Ihh-Expression erklärt werden. In diesem Fall, führte eine Misexpression von Ihh, die von den Fingerspitzen in das umliegende interdigitale Mesenchym übergreift, zur Inaktivierung der interdigitalen Apoptose in dieser Region. Interessanterweise, wurden dabei keine zusätzlichen Signalwege gestört, die während der Separierung der Finger eine Rolle spielen, was darauf hindeutet, dass Ihh selbst eine Rolle während der interdigitalen Apoptose spielen könnte. Eine 4C-Seq Analyse von E14.5 Handproben zeigte, dass die Misexpression höchstwahrscheinlich durch eine einzigartige Enhancer-Promoter-Konstellation am Bruchpunkt der Duplikation induziert wurde. In dieser Studie wurde am Beispiel des Ihh-Lokus gezeigt, dass die zeitliche und lokale Aktivierung der Genexpression durch die komplexe Zusammenwirkung eines Enhancer-Clusters kontrolliert wird. Systemische Veränderungen in der Komposition und Anzahl innerhalb eines Enhancer-Clusters, können je nach Betroffenheit, verschiedenste Auswirkungen haben und somit zu leichten Fehlentwicklungen aber auch schweren Krankheitsbildern führen.