Modulation der p53-Aktivität mittels zellpermeabler Peptide

Abstract

In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Peptiden identifiziert, die die Eigenschaft besitzen, in einem energieunabhängigen und somit nicht endozytotischen Prozess über die Zellmembran translozieren zu können. Diese Eigenschaft wird auch als Zellpermeabilität bezeichnet. Das Neueste in dieser Gruppe von Peptiden ist eine zwölf Aminosäuren umfassende Sequenz aus dem Oberflächenprotein des Hepatitis B Virus, das 1999 identifiziert werden konnte. Dieses sogenannte Translokationsmotif, TLM, ist in der Lage, funktionell aktive Proteine und Peptide über Zellmembranen in das Zytoplasma zu transportieren und somit diverse Signalkaskaden modifizieren zu können. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das PreS2-TLM in der Lage ist, verschiedene Bereiche aus der Tetramerisierungsdomäne des Tumorsuppressors p53 in Zellen transportieren zu können und dort auf die p53 Lokalisation, dessen Aktivität als transkriptioneller Aktivator sowie Initiator des Zellzyklusarrest Einfluss zu nehmen. Hierbei haben sich für verschiedene Bereiche von p53 unterschiedliche Funktionen ergeben. So konnte gezeigt werden, daß ein a-helicales Segment aus der p53-Tetramerisierungsdomäne, TLM- p53teta, inhibitorisch auf die zytoplasmatisch-nukleäre Translokation im Zuge der p53 Aktivierung wirken kann und somit einer Apoptoseinduktion oder einem Zellzyklusarrest entgegen wirkt. Hingegen konnte für ein weiteres Konstrukt, TLM-p53tetba und TLM-p53tetb, eine Translokationsinduktion, und damit eine Aktivitätssteigerung von p53 nachgewiesen werden. Ob durch diese Fusionspeptide p53 tatsächlich auch in einem solchen Maße stabilisiert und aktiviert werden kann, daß Zellen in Apoptose versetzt werden können, ist momentan Gegenstand weiterer Untersuchungen.

During the last years, a new class of so called cell permeable peptides have been identified. These have the ability to translocate in an energy and endocytotic independent manner through cell membranes. Recently, the Pre-S2-TLM (translocative motive) was identified. It is derived from a twelve amino-acid sequence from the surface antigen of the Hepatitis B Virus. As a tool, it can be used to delivery functionally active proteins or peptides through the cell membrane into the cytoplasm, and to modify signaling pathways as fusion peptides. With our experiments, we were able to show that PreS2-TLM fused to different subdomains of the p53-tetramerization-domain is indeed capable to firstly transport these subdomains into the cytoplasm and, secondly, modify p53 localization and its activity as a transcriptional activator. For the different subdomains of the p53-tetramerization-domaine, our data suggest different functionalities. The alpha-helical segment of the p53-tetramerization-domain inhibits the nuclear translocation from the cytoplasm during p53-activation and therefore inhibits cell cycle or apoptosis inducing capabilities of p53. For the beta-sheet and the complete tetramerization domain, which consist of the above mentioned beta-sheet and alpha-helix, we observed a p53-translocation in the nucleus, p53-activation and p53-dependent induction of luciferase in several reporter gene assays. We were also able to generate a cell line for each of the fusion peptides. Whether it is possible to stably activate p53 in tumor cells, is under investigation.