Urea Transport in Sheep Rumen Epithelium in vitro: Modulation by luminal Ammonia and pH

Abstract

It has been well established from previous in vivo studies that urea is recycled to rumen across rumen epithelium via trans-cellular passive diffusion (urea concentration gradient between blood and rumen acts as main driving force) and urea recycling is modulated by crude protein in the diet. According to previous researches, the urea transport from blood to rumen is modulated by the luminal protein fermentation products SCFA, CO2 and ammonia. SCFA and CO2 stimulate urea recycling while ammonia has an inhibitory effect. It was therefore, the intention of this study to investigate the mechanism of urea transport regulation by ammonia, luminal pH, and SCFA/CO2. Using conventional Ussing chamber technique, in vitro, urea transport across the rumen epithelium was carried out to study these effects on ruminal urea transport. The following results were obtained: 1\. Urea transport rate is inhibited by luminal ammonia in both directions (blood to rumen and rumen to blood). The negative effect of ammonia is enhanced with increasing luminal ammonia concentration up to 5 mmol∙l-1. Above 5 mmol∙l-1, ammonia does not exert further inhibition of urea transport. Low concentration of ammonia (0.1 mmol∙l-1) stimulates urea transport rate. 2\. Two forms of ammonia are present in the ruminal fluid at physiologic pH: NH3 and NH4+ according the Henderson- Hasselbalch-Equation. It is concluded that the effect of ammonia is mediated by NH4+. Alterations of the potential difference of the apical membrane, PDa, and hence the driving force for luminal uptake of NH4+ into the epithelial cells caused corresponding changes of urea transport: Depolarization of PDa (= reduced uptake of NH4+) causes enhanced urea transport rates and hyperpolarization the opposite effect. 3\. Urea transport rate is linearly stimulated by increasing luminal SCFA concentration. This stimulation is significantly reduced by luminal ammonia and the relative degree of inhibition by ammonia is the same at all SCFA concentrations. Hence, increasing SCFA concentrations, which stimulate urea transport, does not overcome the inhibitory effect of ammonia. 4\. Urea transport rate is modulated by luminal pH in the presence and absence of luminal ammonia. The range of luminal pH from 7.4 to 5.4 induced a bell-shaped change of urea transport with significant lower flux rates below pH 6.6 in the presence of ammonia. 5\. No correlation exists between urea transport rate and tissue conductance indicating predominantly transcellular urea transport. 6\. Urea transporter B has been detected in sheep rumen epithelium. The alignment with Bos taurus urea transporter showed 95.9% identity. It is concluded that ruminal transport rate is stimulated by SCFA/CO2 and inhibited by luminal ammonia in the form of NH4+. The negative effect of ammonia is dependent on the presence of SCFA and luminal pH. The mechanism of acute modulation of urea transport rateby ammonia is still unclear. There is no doubt that SCFA, CO2 and ammonia modulate ruminal transport rate by changing intracellular pH, but alterations of pHi does not explain sufficiently the obtained data. It is suggested that ammonia (NH4+) interacts with the urea transporter. However, more experiments are needed to prove this hypothesis.

Es ist aus vielen in vivo Untersuchungen bekannt, dass Harnstoff durch das Pansenepithel transportiert wird. Der Konzentrationsgradient zwischen Blut und Pansenflüssigkeit ermöglicht diesen passiven Transport in den Pansen, der auch als Harnstoffrecycling bezeichnet wird. Der Rohproteingehalt des Futters korreliert negativ mit der Transportrate (Recycling) und es ist aus Untersuchungen bekannt, dass der ruminale Harnstofftransport durch die Fermentationsprodukte SCFA, CO2 und Ammoniak beeinflusst wird. SCFA und CO2 stimulieren und Ammoniak hemmt den Harnstofftransport. Es war daher die Absicht der vorliegenden Untersuchungen, die Mechanismen näher zu charakterisieren, die die Modulation des Harnstofftransports durch Ammoniak, den lunimalen pH und SCFA/CO2 verursachen. Die Untersuchungen wurden in-vitro mit isolierten Epithelien des Pansens von Schafen mit der konventionellen Ussing Kammer Methode durchgeführt. Folgende Versuchsergebnisse wurden ermittelt: 1\. Der unidirektionale Transport von Harnstoff (Transport von der Lumen- zur Blutseite und umgekehrt) wird durch die luminale Ammoniakkonzentration gehemmt. Eine maximale Hemmung wurde bei einer Konzentration von 5 mmol∙l-1 beobachtet. Höhere Konzentrationen verursachten keine weitere Reduzierung. Sehr niedrige Ammoniakkonzentrationen (0.1 mmol∙l-1) stimulierten – wenn auch in geringem Umfang - signifikant den Harnstofftransport. 2\. Ammoniak liegt in dem pH Bereich der Pansenflüssigkeit (5.4 – 7.4) in zwei Formen vor entsprechend der Henderson-Hasselbalch- Gleichung: NH3 and NH4+. Der Effekt von Ammoniak auf den Harnstofftransport wird durch NH4+ vermittelt. Veränderungen der Potentialdifferenz der apikalen Membran (PDa) und somit der Triebkraft für die passive Aufnahme von NH4+ in die Epithelzelle verursachen entsprechende Zu- bzw. Abnahmen der Transportraten von Harnstoff. Eine Depolarisation von PDa (= Reduzierung der NH4+ Aufnahme) erhöht den Transport von Harnstoff und eine Hyperpolarisation bewirkt den umgekehrten Effekt. 3\. Der Transport von Harnstoff wird mit steigender Konzentration von SCFA linear und signifikant stimuliert. Diese Stimulierung wird signifikant durch Ammoniak gehemmt. Die relative Hemmung des Harnstofftransportes veränderte sich jedoch nicht, d. h. dass steigende SCFA Konzentrationen die hemmende Wirkung von Ammoniak nicht kompensieren. 4\. Der Transport von Harnstoff wird maßgeblich durch den luminalen pH-Wert bestimmt. pH-Werte im Bereich von 5.4 – 7.4 induzieren eine glockenförmige Zu- und Abnahme des Harnstofftransports. Ammoniak (5 mmol∙l-1) verursacht eine signifikante Abnahme des Transportes ohne Veränderung der Form der Zu- und Abnahmen. Mit und ohne Ammoniak wurden maximale Transportraten im pH-Bereich von 5.8 – 6.2 beobachtet. 5\. Der Transport von Harnstoff korreliert nicht mit der Gewebeleitfähigkeit. Diese Beobachtung unterstützt die Annahme eines transzellulären Transportes. 6\. Der Urea Transporter B (UT-B) wurde im Pansenepithel nachgewiesen und weist eine Übereinstimmung mit dem bovinen UT-B von 95.9 % auf. Die erhaltenen Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass der Transport von Harnstoff durch SCFA/CO2 stimuliert und durch Ammoniak gehemmt wird. In beiden Fällen wird die Wirkung der Fermentationsprodukte maßgeblich durch den luminalen pH-Wert bestimmt. Es besteht kein Zweifel, dass die Effekte von CO2 und SCFA mit einer Abnahme des intrazellulären pH-Wertes, pHi, korrelieren, der die Aktivität des UT-B modulieren könnte. Ferner wird die Hemmung des Harnstofftransportes durch Ammoniak nur beobachtet, wenn SCFA/CO2 vorhanden sind und der luminale pH-Wert < 7.0 beträgt. Der Effekt von Ammoniak muss jedoch weiterhin als nicht geklärt angesehen werden. Eine Interaktion von NH4+ mit dem UT-B wird als mögliche Erklärung zur Diskussion gestellt.