dc.contributor.author
Gimber, Niclas
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:00:20Z
dc.date.available
2016-08-19T08:03:02.467Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7262
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11461
dc.description.abstract
Our central nervous system relies on synaptic transmission, which is based on
the release of neurotransmitters from synaptic vesicles (SVs) by
Ca2+-triggered exocytosis. SV fusion with the plasma membrane at active zones
is followed by endocytosis at the periactive zone. Although SV cycling is a
fundamental process for neurotransmission at chemical synapses and exo- and
endocytosis at the mammalian presynapse has been the subject of intense
investigations over the last decades, the fate of newly exocytosed SV proteins
remained largely unknown. Recent findings uncovered that upon moderate
electrical stimulation, instead of newly exocytosed SV proteins, a
preassembled “readily retrievable pool” of SV proteins is retrieved from the
plasma membrane at the periactive zone. However, what happens to newly
exocytosed SV proteins has remained unknown. To address this question, I
developed an assay to spatiotemporally characterize newly exocytosed SV
proteins upon moderate electrical stimulation. I furthermore identified
molecular factors that mediate post-exocytic dynamics. My data demonstrates
that, in hippocampal neurons, newly exocytosed SV proteins spread out from the
active zone via Brownian motion. Considering, that previous research shows
that the removal of released proteins from active zones is essential for
effective exocytosis, it is even more remarkable that the initial spread of
newly exocytosed SV proteins is not supported by active transport. After a few
seconds of diffusion, most molecules remain confined within the presynaptic
plasma membrane. Only ~ 10 % of the molecules escape rapidly into the axon.
After confinement, SV proteins recluster slowly. Strikingly, all investigated
SV proteins show similar diffusional spread, confinement and reclustering.
Super-resolution microscopy reveals that reclustered SV proteins contribute to
nano-clusters that are closely associated with the clathrin-based endocytic
machinery at periactive zones. It is therefore conceivable that nano-clusters
of endocytic proteins mediate the trapping of newly exocytosed SV proteins at
the periactive zone and transform newly exocytosed SV proteins into a
preassembled readily retrievable pool. I furthermore show that the confinement
of newly exocytosed synaptobrevin 2 (Syb2) is reduced, but not abolished, by
interfering with the interaction with the clathrin-based endocytic machinery,
e. g. the Syb2-specific adaptors AP180 and CALM. A similar reduction applies
to the extent of reclustering. This suggests that confinement and reclustering
are mediated by the clathrin-based endocytic machinery, together with a so far
unidentified diffusion barrier. Furthermore, the Syb2 diffusion is accelerated
by a mutation of the binding site for AP180 and CALM. This is in agreement
with an early association of AP180 or CALM with Syb2. Although the acute post-
exocytic confinement of AP180- and CALM-binding deficient Syb2 is only
partially impaired, this study shows that Syb2 binding to its specific
endocytic adaptors finally prevents a major loss into the axon over time.
Taken together, these findings demonstrate that diffusional spread,
confinement and reclustering are essential processes of the SV cycle and
partially rely on the clathrin-based endocytic machinery.
de
dc.description.abstract
Signale werden an den chemischen Synapsen unseres Nervensystems durch
Neurotransmitter übertragen. Diese Neurotransmitter werden durch die
Ca2+-abhängige Fusion von synaptischen Vesikeln (SV) mit der Plasmamembran an
aktiven Zonen freigesetzt. An der periaktiven Zone werden die Bestandteile von
SV wieder recycelt. Obwohl dieser Kreislauf ein elementarer Bestandteil der
Signalübertragung an chemischen Synapsen ist, und die Exo- und Endozytose an
der Präsynapse in der Vergangenheit eingehend untersucht wurden, ist der
Verbleib von neu exozytierten SV Proteinen noch weitgehend ungeklärt. Erst
kürzlich konnte gezeigt werden, dass nach einer moderaten elektrischen
Stimulation nicht die neu exozytierten SV Proteine, sondern SV Proteine des
sogenannten „Readily Retrievable Pool” an der periaktiven Zone endozytiert
werden. Der Verbleib der neu exozytierten SV Proteine blieb jedoch weiterhin
unklar. Um den Verbleib dieser Proteine aufzuklären habe ich einen Assay
entwickelt mit welchem die räumliche Ausbreitung von neu exozytierten SV
Proteinen nach elektrischer Stimulation untersucht werden kann. Außerdem
konnte ich molekulare Faktoren identifizieren, welche die Bewegung von SV
Proteinen nach der Exozytose beeinflussen. Die vorliegende Arbeit zeigt in
hippocampalen Neuronen, dass sich die neu exozytierten SV Proteine durch
Diffusion ausbreiten. Frühere Arbeiten weisen darauf hin, dass das Entfernen
von neu exozytierten SV Proteinen von der aktiven Zone für die effektive
Exozytose essenziell ist. Daher ist es bemerkenswert, dass für die Ausbreitung
von neu exozytierten SV Proteinen kein aktiver Transport benötigt wird. Nach
wenigen Sekunden der Diffusion wird ein Großteil der Moleküle an der
präsynaptischen Plasmamembran zurückgehalten. So gelangen nur etwa 10% der neu
exozytierten Proteine in das angrenzende Axon. Nach der anfänglichen
Ausbreitung kommt es zum „Reclustering“, die SV Proteine ziehen sich dabei
langsam wieder auf einen engeren Bereich zurück. Alle untersuchten SV Proteine
zeigten auffallende Ähnlichkeiten in der Ausbreitung und im „Reclustering“.
Mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie zeigt diese Arbeit, dass neu
exozytierte SV Proteine zusammen mit dem Clathrin-basierenden Endozytose-
Apparat in dem Bereich der periaktiven Zone Nanocluster bilden. Daher ist es
denkbar, dass ein in Nanoclustern organisierter Endozytose-Apparat in der
periaktiven Zone neu exozytierte SV Proteine immobilisiert und daraus den
„Readily Retrievable Pool” aufbaut. Weiterhin zeige ich, dass sobald die
Interaktion zu dem Clathrin-basierenden Endozytose-Apparat durch die
Syb2-spezifischen Adapter AP180 und CALM fehlt, sich neu exozytiertes Syb2
zwar weiter ausbreitet, jedoch zunächst nicht frei ins Axon diffundiert.
Dieser Anstieg des Ausbreitungsbereichs bleibt auch nach dem „Reclustering“
bestehen. Dies deutet darauf hin, dass neben dem Clathrin-basierende
Endozytose-Apparat eine weitere Barriere für die Begrenzung der Diffusion und
das „Reclustering“ von neu exozytierten SV Proteinen verantwortlich ist. Des
Weiteren zeigt diese Arbeit, dass die Diffusion von Syb2 durch die Mutation
von dessen AP180- und CALM-Bindungsstelle beschleunigt wird. Daher ist eine
frühzeitige Interaktion von AP180 oder CALM mit Syb2 wahrscheinlich. Obwohl
die akute Begrenzung von neu exozytiertem Syb2 von einer fehlenden Interaktion
mit AP180 und CALM nur teilweise betroffen ist, zeige ich, dass AP180 und CALM
auf lange Sicht einen maßgeblichen Verlust von Syb2 in das Axon verhindern.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Diffusion, deren Begrenzung und das
„Reclustering“ von neu exozytierten SV Proteinen wesentliche Prozesse des SV
Zyklus sind und unter anderem von dem Clathrin-basierten Endozytose-Apparat
vermittelt werden.
de
dc.format.extent
147 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
synaptic vesicle
dc.subject
release-site clearance
dc.subject
live-cell imaging
dc.subject
super-resolution microscopy
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Imaging post-exocytic dynamics of synaptic vesicle proteins
dc.contributor.contact
niclas.gimber@charite.de
dc.contributor.inspector
Prof. Dr. Helge Ewers
dc.contributor.inspector
Prof. Dr. Sutapa Chakrabarti
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker Haucke
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Stephan Sigrist
dc.date.accepted
2016-05-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000102391-5
dc.title.translated
Lichtmikroskopische Untersuchung der Post-Exozytose-Dynamiken von synaptischen
Vesikelproteinen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000102391
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000019455
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access