Genexpressionsprofil einer vierfach transient genmodifizierten Nierenkarzinomzelllinie

Abstract

Nierenzellkarzinome gehören zu den am häufigsten auftretenden urologischen Tumorarten. Mit konventionellen Behandlungsmethoden werden in der Regel nur unzureichende Behandlungserfolge erzielt. Seit wenigen Jahren kommen nun neue Wirkstoffe zum Einsatz. Diese Thyrosin-Kinase- und Angiogenese-Inhibitoren interagieren mit spezifischen Molekülen die mit dem Wachstum und der Progression des Tumors assoziiert sind und blockieren so dessen Wachstum und Ausbreitung. Dennoch sind vollständige, dauerhafte Remissionen eher selten zu beobachten. Dies macht es notwendig alternative Behandlungsstrategien zu erforschen. Die Firma Mologen AG arbeitet seit einigen Jahren an der Entwicklung eines zellbasierter Wirkstoffes, der das Prinzip der Tumorvakzinierung verfolgt. Dabei werden Zellen einer Nierenkarzinomzelllinie (B25-MOL) durch das Einbringen von vier MIDGE®-DNA-Vektoren, die kostimulatorische Moleküle (CD80, CD154) bzw. immunstimulierende Zytokine (IL-7, GM-CSF) kodieren, genetisch modifiziert und als Wirkstoffzellen eingesetzt. Bedingt durch diese genetische Modifikation sowie weiterer Effekte, verursacht durch den Herstellungsprozess, wird der Phänotyp der B25 -MOL-Zellen verändert. Unter Verwendung der DNA-Microarray-Technologie wird in der vorliegenden Arbeit untersucht, wie sich das Genexpressionsprofil der Wirkstoffzellen gegenüber den nativen B25-MOL-Zellen verändert. Anhand der Ergebnisse der Microarray-Analysen ergibt sich für insgesamt 392 Gene eine differentielle Expression (relative Expressionsänderung > 3). Der Fokus der funktionellen Analysen liegt auf den biologischen Zusammenhängen, die eine Auswirkung auf das angestrebte Wirkprinzip haben könnten. Die vermehrte Produktion von Zytokinen sowie die Expression kostimulatorischer Moleküle durch die Wirkstoffzellen trägt dazu bei, dass sowohl professionelle APC, wie auch Effektorzellen des Immunsystems besser rekrutiert und aktiviert werden können. So zeigen vorläufige Ergebnisse einer laufenden klinischen Studie mit dSLIM® in Kombination mit genetisch modifizierten Tumorzellen, die CD80, CD154, IL-7 und GM-CSF exprimieren, eine vielversprechende Wirksamkeit bei Patienten mit metastasierenden Nierenzellkarzinom (Grünwald et al., 2013). Dies ist in erster Linie auf die Expression dieser vier Moleküle durch die Wirkstoffzellen zurückzuführen. Ebenso trägt vermutlich die sekundär verursachte verstärkte Expression weiterer immunstimulatorischer Moleküle und Zytokine zu diesem Effekt bei. Die verstärkte Expression von Rezeptoren der Tumornekrosefaktoren kann zu einer erhöhten Sensitivität gegenüber einer Rezeptor-induzierten Apoptose führen. Eine signifikante Veränderung der Expression von Genen, die an der Antigen-Prozessierung oder -Präsentation beteiligt sind, kann nicht beobachtet werden. Das Expressionsniveau der MHC- Klasse-I-Moleküle in den Wirkstoffzellen bleibt gegenüber den B25-MOL-Zellen unverändert hoch. Die Wirkstoffzellen sind in der Lage Proteinfragmente zelleigener Proteine, unter anderem auch Tumor-assoziierte Antigene (TAA), zu präsentieren und durch die Expression kostimulatorischer Moleküle (z.B. CD80) CD8+ T-Lymphozyten direkt zu aktivieren. Viele TAA zeigen eine relativ hohe mRNA-Expression in den Wirkstoffzellen. Eine differentielle Genexpression ist dagegen nur bei wenigen zu beobachten. Die Ergebnisse der genomweiten Expressionsanalysen zeigen, dass herstellungsbedingt nur geringfügige Veränderungen des Expressionsprofils zu beobachten sind, die vermutlich keinen negativen Effekt auf das angestrebte Wirkprinzip haben. Die durch das Einbringen der vier MIDGE®-DNA-Vektoren verursachten Veränderungen des Expressionsprofils, verstärken voraussichtlich das angestrebte Wirkprinzip, vermindern es jedoch keinesfalls.

Renal cell carcinoma (RCC) is one of the most common urological cancer. Conventional treatments result in only limited success. Recently, new agents for targeted cancer therapies were approved. These tyrosine kinases inhibitors and angiogenesis inhibitors block the growth and spread of cancer cells by interfering with specific molecules involved in tumor growth and progression. However, complete and durable remissions are rare. Therefore alternate therapeutic strategies are demanded. The company Mologen AG has developed a cell-based therapy for tumor vaccination. Thereby cells of a renal cell carcinoma cell line (B25-MOL) are genetically modified by in vitro transfection with four MIDGE® DNA vectors encoding co-stimulatory molecules (CD80, CD154) and cytokines (IL-7, GM-CSF) and serve as active component in the tumor vaccine. As a result of gene modification and further effects, caused by the manufacturing process the phenotype of B25-MOL cells is changed. Using the DNA-Microarray technology the overall aim of this thesis was to elucidate the alterations of the gene expression profile of B25-MOL cells and vaccine cells. The comparison of gene expression profiles of native B25-MOL cells and vaccine cell results in a total of 392 differentially expressed genes (change in intensity of expression > 3). The focus of the research was on the biological context with potential impact on the mode of action of the tumor vaccine. The increased production of cytokines and the expression of co- stimulatory molecules by the vaccine cells may contribute to improved recruitment and activation of APC and immunological effector cells. Corresponding to this, preliminary Data of an on-going clinical study using dSLIM® in combination with modified tumor cells, that express CD80, CD154 and IL-7 and GM-CSF, show promising efficacy in patients with metastatic renal cell carcinoma (Grünwald et al., 2013). This is mainly due to the expression of these four molecules through the vaccine cells. Besides this, increased expression of other immunostimulatory molecules and cytokines due to secondary effects probably contributes to this effect. Additionally, the increased expression of certain TNF receptors, may lead to an increased sensitivity against receptor-mediated apoptosis. No significant change in expression of genes that are involved in processing and presentation of antigens is observed. The expression level of MHC class I molecules on cell surface remains unchanged when comparing native B25-MOL cells with vaccine cells. Expression of co-stimulatory molecules as CD80 enables the vaccine cells to present protein fragments of antigens (including TAA) and, as a consequence, activate effector T-lymphocytes directly. A variety of TAA exhibit a relatively high gene expression level in vaccine cells. In contrast, only a few of these genes show an altered gene expression level . Comparison of B25-Mol cells and vaccine cells by genome-wide expression analysis show mainly stable gene expression profiles. These minor changes in the expression profile induced by the manufacturing process are probably irrelevant for the mode of action. Expression of the four proteins encoded by the MIDGE® DNA vectors result in secondary effects that probably enhance the intended mode of action.