Charakterisierung pankreatischer INS-1 Insulinoma Zellen unter chronisch hoher Glukosekonzentration als Modell für Glukosetoxizität

Abstract

Der Glukosestoffwechsel der pankreatischen Betazellen und die sich daraus ergebende Erhöhung des intrazellulären Konzentrationsverhältnisses von ATP zu ADP stellt das metabolische Signal für die Insulinsekretion dar. Im gesunden, normalen Zustand wird nach akuter Glukoseaufnahme das sezernierte Insulin durch dessen Neusynthese ersetzt. Dieser Prozess setzt eine funktionierende mRNA-Synthese voraus. Unter chronisch hyperglykämischen Bedingungen ist nicht nur die Insulintranskription, sondern auch die Proteinbiosynthese und Sekretion gestört. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit Glukosestoffwechselwege zu identifizieren, die bei der Regulation der Insulingenexpression eine wesentliche Rolle spielen könnten. Des Weiteren sollte eine Assoziation zwischen Glukosemetabolismus und Proteinkinase- assoziierter Verminderung der Insulingenexpression gefunden werden. Zu diesem Zweck wurden an kultivierten pankreatischen Ratteninsulinomazellen (INS-1) Versuchsserien mit unterschiedlichen Fragestellungen durchgeführt. Anfänglich wurden anhand von Metabolitenprofilanalysen detaillierte Untersuchungen hinsichtlich der Glukoseverstoffwechselung unter chronisch hohen Glukosebedingungen durchgeführt. Aus den Analysen ergab sich, dass chronisch hohe Glukosekonzentrationen überwiegend zu metabolischen Veränderungen im Glukosestoffwechsel führen. Am deutlichsten waren Anreicherungen von glykolytischen und mitochondrialen Metaboliten, mit besonders kumulierenden Mengen von alpha-Ketoglutarat, sowie eine Akkumulation von Metaboliten des Pentosephosphatweges. Dabei war besonders eine zelluläre Anreicherung organischer Säuren auffallend. Eine starke Akkumulation der Pentosephosphatwegsmetaboliten Glucono-delta-lacton, 6-Phosphoglukonsäure und Glukonsäure und von Carbamylaspartat, initialer Teil des DNA/RNA Syntheseweges war nur bei chronisch hohen Glukosekonzentrationen zu verzeichnen. Die Spiegel dieser Metaboliten waren in INS-1 während der Kultivierung bei niedriger Glukose extrem niedrig beziehungsweise nicht detektierbar. Bei Glukonat handelt es sich um einen in pankreatischen Zellen neu identifizierten Metaboliten, dessen Herkunft als Glukoseabbauprodukt mit isotopenmarkierter [13C]Glukose nachgewiesen werden konnte. Dessen verstärkte Ausscheidung ins Medium könnte zum einen als Zeichen einer Stoffwechselüberbelastung gedeutet werden und könnte zum anderen eine Möglichkeit der Zelle aufzeigen, eine Anreicherung spezifischer Glukoseabbauprodukte zu kompensieren. Parallel zu den Metabolitenprofilanalysen sollte in INS-1 Zellen bei chronisch hohen Glukose, nach phänotypischer und genotypischer Charakterisierung, ein Proteinsignalweg, assoziiert mit einer Verminderung der Insulingenexpression, identifiziert werden. Voruntersuchungen zeigten, dass chronisch hohe Glukosekonzentrationen zu einer Verminderung der Insulingenexpression, assoziiert mit einer Verminderung der Insulingeninitiatoren MafA, Beta2, PDX-1 und des Differenzierungsfaktors Pax6 führten. Zusätzlich hatten chronisch hohe Glukosekonzentrationen eine Entdifferenzierung der Betazellen zur Folge, was sich in einer Induktion der Proliferation äußerte. Eine verstärkte Proliferation war möglicherweise auf eine erhöhte Aktivität der ERK1/2 Proteinkinase zurückzuführen. Die Hemmung der ERK1/2 Kinaseaktivität mit PD98059 resultierte in einer Erholung der Insulingenexpression und der positiven Insulingenregulatoren MafA, Beta2, PDX-1 und Pax6 nach chronisch hoher Glukoseexposition. Abschließend sollte geklärt werden, ob Metabolitenveränderungen an der Verminderung der Insulingenexpression beteiligt sein könnte und inwiefern die ERK1/2 Kinase dabei eine zentrale Rolle spielt. Eine Inhibierung der 6-Phosphoglukonsäuredehydrogenase des Pentosephosphatweges mit 6-AN resultierte ähnlich wie bei 16 mM Glukose in einer Akkumulation von Glucono-delta-lacton, 6-Phosphoglukonsäure und Glukonsäure und ging mit einer Verminderung der Insulingenexpression einher. Die Inhibierung der ERK1/2 Kinase hatte trotz chronisch hoher Glukosekonzentrationen keine Verminderung der Insulingenexpression zur Folge und resultierte in einer Verrinderung der Pentosephosphatwegmetaboliten Glucono-delta-lacton, 6-Phosphoglukonsäure und Glukonsäure, aber auch von alpha-Ketoglutarat. Die hier geschilderten Ergebnisse verdeutlichen, dass hohe Glukosekonzentrationen langfristig eine, unter normalen Bedingungen nicht auftretende, intrazelluläre Anreicherung einer Vielzahl von Glukoseabbauprodukten in Betazellen zur Folge haben. Besonders auffällig ist ein kritischer Anstieg organischer Säuren, welche mit einer ERK1/2 Kinase - vemittelten Verminderung der Insulingenexpression assoziiert sein könnten.

Glucose metabolism of pancreatic beta cells and the resulting increase of the intracellular ATP/ADP ratio are the metabolic signal for insulin secretion. Under normal nonpathological conditions the secreted insulin is replenished by newly synthesed insulin in a process which requires fully functioning mRNA synthesis. Under chronic hyperglycaemic conditions not only insulin transcription, but also protein synthesis and secretion is impaired. It was therefore the aim of this work to identify glucose metabolic pathways which could play an important role during regulation of insulin gene expression and in doing so investigate the potential association between glucose metabolism and a proteinkinase-associated reduction of insulin gene expression. Utilising metabolite profiling analyses of rat-derived cultivated pancreatic insulinoma cells (INS-1) experiments were undertaken with a view to shed light on the effects of chronic high glucose conditions on glucose metabolism. These analyses permitted the determination that such conditions led to wide-ranging changes to this system. Among the most dominant effects were the accumulation of glycolytic and mitochondrial metabolites, in particular of alpha- ketoglutarate as well as of metabolites of the pentose phosphate pathway (PPP) in addition to a cellular accumulation of a number of organic acids. A particularly great accumulation of the PPP metabolites glucono-delta-lactone, 6-phosphogluconic acid and gluconic acid in addition to a similar accumulation of carbamyl-aspartic acid, a precursor in the synthesis of DNA and RNA, all of which were only detectable at significant levels under chromic high glucose conditions. Gluconic acid can be considered a newly identified metabolite in pancreatic beta cells, the origin of which as a glucose degradation product was unambiguously determined using isotopically-labelled [13C]-glucose. The increased secretion of this compound into the growth medium could be interpreted as a metabolic overload and as a indication that cells compensate for this by eliminating specific glucose by-products. Parallel to these metabolite profiling analyses, the INS-1 cells were also phenotypically and genotypically characterised in an attempt to identify a protein signal pathway associated with insulin gene expression reduction. Preliminary experiments showed that chronic high glucose levels led to decreased insulin gene expression, associated with decreased levels of transcription factors, such as MafA, Beta2, PDX-1 and differentiation factors, such as PAX6. Additionally, chronic high glucose levels resulted in increased proliferation of INS-1 which was thought to be a result of an increased ERK1/2 protein kinase activity. Inhibition of ERK1/2 activity with PD98059 prevented chronic high glucose- induced reduction of insulin gene expression and of transcription factors MafA, Beta2, PDX-1 und Pax6. Finally, it was intented to clarify whether metabolite changes participated in the reduction of insulin gene expression and to what extent ERK1/2 kinase is involved. Inhibition of the PPP enzyme 6-phosphogluconic acid dehydrogenase at low glucose levels with 6-aminonicotinamide resulted in a similar accumulation of glucono-delta- lactone, 6-phosphogluconic acid and gluconic acid as observed under high glucose conditions and also resulted in a reduction of insulin gene expression. The inhibition of ERK1/2, which prevented a reduction of insulin gene expression, also prevented such an accumulation of the PPP metabolites glucono-delta-lactone, 6-phosphogluconic acid and gluconic acid, but also alpha-ketoglutarate under chronic high glucose conditions. The results outlined here indicate that high glucose levels in the long term cause the intracellular enhancement of a number of glucose metabolic by-products in beta cells, which are not apparent under normal conditions. Especially noticeable was a critical increase of organic acids, which might be associated with a ERK1/2 kinase – mediated reduction of insulin gene expression.