dc.contributor.author
Philippi, Susanne
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:58:22Z
dc.date.available
2015-01-14T13:27:49.518Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7211
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11410
dc.description.abstract
Precursor-mRNA (pre-mRNA) cis-splicing is an attractive target for the repair
of genes whose transcription regulation is determinative for protein function,
as it is the case for the dysferlin (DYSF) gene. Mutation of the DYSF gene
leads to muscular dystrophies of different disease phenotypes the majority of
which manifests as limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) and Miyoshi
myopathy 1. Two strategies of pre-mRNA cis-splicing modification for DYSF gene
repair were pursued in the presented thesis, (i) spliceosome-mediated pre-mRNA
trans-splicing (SMaRT) by an engineered pre-mRNA trans-splicing molecule (PTM)
and (ii) antisense oligonucleotide (AON)-induced excision of DYSF exon 32 from
DYSF pre-mRNA. SMaRT by a PTM allows substitution of large portions of a pre-
mRNA and the preservation of the full-length mRNA transcript of a gene. The
approach is particularly suitable for DYSF gene repair, as disease-causing
mutations were identified in the entire DYSF open-reading frame and gene
replacement therapy by the expression of curtailed Mini-Dysferlin does not
rescue muscular dystrophy. For the design of an efficient trans-splicing
strategy, introns of the DYSF pre-mRNA which revealed disparately strong
splicing signals were targeted by PTMs in human Dysferlin-deficient myoblasts.
Introns were targeted by PTMs encoding different pre-mRNA binding domains to
either localize the PTM in close proximity of the intron internal 5’splice
site or to mask the intron internal 3’splice site. Cis-splicing of target
introns encoding weak splicing signals was more susceptible to manipulation by
a PTM then of strongly defined introns and PTM localisation in close proximity
to the 5’splice site and thus to the active spliceosomal U1 snRNP during the
splicing process emerged as most effective. Trans-splicing of two DYSF target
introns led to Dysferlin rescue in the DYSF-/- mouse model. The level of
protein recovery, however, was moderate, remindful of low protein yields
obtained in previous trans-splicing strategies for other genes. Nevertheless,
concordant qualities among successfully targeted DYSF introns and previously
targeted introns by other strategies could be identified that might facilitate
a systematic choice of future trans-splicing target introns. The strategy of
AON-induced excision of DYSF exon 32 was based on the knowledge that a
naturally occurring DYSF exon 32-excision led to mild LGMD2B in a patient that
was ambulant until high age. AONs of the tricyclo-DNA backbone chemistry were
applied, which due to the additional two carbon ring entities within the
single nucleoside are more rigid and show higher binding affinity to RNA than
DNA does. The in vitro and in vivo application of designed AON sequences
corroborated findings of previous studies in which for particular exons
masking of exon internal splice enhancer sequences induced exon exclusion most
efficiently. Two of the designed exon internally binding AONs induced
Dysferlin rescue in Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts.
de
dc.description.abstract
Das cis-Spleißen von präkursor-mRNA (prä-mRNA) ist ein geeigneter
Angriffspunkt für die Korrektur von Genen, deren Transkriptionsregulation, wie
im Fall des dysferlin (DYSF) Gens, ausschlaggebend für die Funktionalität des
enkodierten Proteins ist. Mutationen des DYSF Gens führen zu unterschiedlichen
Arten der Muskeldegeneration, vorrangig zur Gliedergürteldystrophie des Typs
2B oder Muskeldystrophie Miyoshi 1. Es wurden zwei Strategien zur Modifikation
des prä-mRNA cis-Spleißens zur DYSF RNA-Korrektur etabliert, das Spleißosom-
vermittelte prä-mRNA trans-Spleißen durch ein technisiertes prä-mRNA trans-
Spleißmolekül (PTM) und das Antisense-Oligonukleotid (AON)-induzierte
Ausschneiden des DYSF Exons 32 aus der DYSF prä-mRNA . SmaRT mittels eines
PTMs erlaubt das Ersetzen von umfagreichen Abschnitten der prä-mRNA und die
Erhaltung des kompletten mRNA-Transkripts eines Gens. Dieser Ansatz eignet
sich besonders zur Korrektur des DYSF Gens, da krankheitserregende Mutationen
innerhalb des gesamten Leserahmens des Gens identifiziert worden sind und die
Gen-Ersatz-Therapie durch Expression eines verkürzten Mini-Dysferlin die
Muskeldegeneration nicht lindert. Für die Entwicklung einer effizienten SmaRT-
Strategie ist der cis-Spleißprozess von DYSF prä-mRNA Introns, die
unterschiedlich starke Spleißsignale aufweisen durch PTMs in humanen
Dysferlin-defizienten Myoblasten angezielt worden. Diese Introns wurden durch
PTMs mit unterschiedlichen prä-mRNA Bindedomänen angegriffen, um das PTM
entweder in die Nähe des Intron internen 5’Spleißsignals zu bringen, oder um
das Intron interne 3’Spleißsignal zu maskieren. Eine Modifikation des cis-
Spleißens durch ein PTM war in Introns, die schwache Spleißsignale kodieren
mittels eines PTMs, welches in der Nähe des 5‘ Spleißsignals und damit des
aktivierten U1 snRNPs lokalisiert, am effizientesten. Das Trans-Spleißen von
zwei der angezielten DYSF prä-mRNA Introns fuehrte zu einer Wiederherstellung
der Dysferlinexpression im Dysf-/- Mausmodell. Eine Wiederherstellung des
Dysferlin Proteins konnte jedoch nur in moderatem Mass detektiert werden, was
an die geringe Effizienz von SmaRT-Strategien, die bereits für andere Gene
entwickelt worden sind, erinnert. Allerdings konnten übereinstimmende
Eigenschaften zwischen effizient angezielten DYSF Introns und Introns, die in
zuvor entwickelten Strategien angezielten wurden, identifiziert werden, die
eine systematische Auswahl der Zielintrons in zukünftigen SmaRT-Strategien
erlauben könnten. Die Strategie des AON-vermittelten Ausschneidens des DYSF
Exons 32 aus der prä-mRNA wurde vor dem Hintergrund entwickelt, dass ein
natürlich vorkommendes Fehlen des DYSF Exons 32 in der prä-mRNA einer
Patientin zu einer milden Gliedergürteldystrophie des Typs 2B führt. Es wurden
AONs mit einem tricyclo-DNA-Rückgrat angewendet, welche durch die zwei
zusätzlichen Kohlenstoffringeinheiten im einzelnen Nukleosid wenig elastisch
sind und eine höhere Bindeaffinität als DNA gegenüber RNA-Molekülen zeigen.
Die in vitro und in vivo Anwendung der AON-Sequenzen haben Ergebnisse voriger
Studien bestätigt, in denen gezeigt wurde, dass das Ausschneiden von
bestimmten Exons am effizientesten durch Maskierung exoninterner
Spleißverstärkender Sequenzen erreicht werden kann. Zwei der entwickelten
exonintern bindenden AONs haben zur Wiederherstellung der Translation des
Dysferlin in humanen Dysferlin defizienten Myoblasten geführt.
de
dc.format.extent
XII, 125 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
spliceosome-mediated pre-mRNA trans-splicing
dc.subject
pre-mRNA splicing
dc.subject
dysferlinopathy
dc.subject
antisense-oligunucleotide
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
RNA-based therapies for dysferlinopathies
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Simone Spuler
dc.contributor.furtherReferee
Luis Garcia, PhD, DR1
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Florian Heyd
dc.contributor.furtherReferee
Isabelle Marty, PhD, DR2
dc.contributor.furtherReferee
Francois-Jerome Authier, MD, PU-PH
dc.date.accepted
2014-09-25
dc.date.embargoEnd
2015-01-01
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000098024-2
dc.title.translated
RNA-basierte Therapien für Dysferlinopathien
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000098024
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000016168
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access