RNA-based therapies for dysferlinopathies

Abstract

Precursor-mRNA (pre-mRNA) cis-splicing is an attractive target for the repair of genes whose transcription regulation is determinative for protein function, as it is the case for the dysferlin (DYSF) gene. Mutation of the DYSF gene leads to muscular dystrophies of different disease phenotypes the majority of which manifests as limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) and Miyoshi myopathy 1. Two strategies of pre-mRNA cis-splicing modification for DYSF gene repair were pursued in the presented thesis, (i) spliceosome-mediated pre-mRNA trans-splicing (SMaRT) by an engineered pre-mRNA trans-splicing molecule (PTM) and (ii) antisense oligonucleotide (AON)-induced excision of DYSF exon 32 from DYSF pre-mRNA. SMaRT by a PTM allows substitution of large portions of a pre- mRNA and the preservation of the full-length mRNA transcript of a gene. The approach is particularly suitable for DYSF gene repair, as disease-causing mutations were identified in the entire DYSF open-reading frame and gene replacement therapy by the expression of curtailed Mini-Dysferlin does not rescue muscular dystrophy. For the design of an efficient trans-splicing strategy, introns of the DYSF pre-mRNA which revealed disparately strong splicing signals were targeted by PTMs in human Dysferlin-deficient myoblasts. Introns were targeted by PTMs encoding different pre-mRNA binding domains to either localize the PTM in close proximity of the intron internal 5’splice site or to mask the intron internal 3’splice site. Cis-splicing of target introns encoding weak splicing signals was more susceptible to manipulation by a PTM then of strongly defined introns and PTM localisation in close proximity to the 5’splice site and thus to the active spliceosomal U1 snRNP during the splicing process emerged as most effective. Trans-splicing of two DYSF target introns led to Dysferlin rescue in the DYSF-/- mouse model. The level of protein recovery, however, was moderate, remindful of low protein yields obtained in previous trans-splicing strategies for other genes. Nevertheless, concordant qualities among successfully targeted DYSF introns and previously targeted introns by other strategies could be identified that might facilitate a systematic choice of future trans-splicing target introns. The strategy of AON-induced excision of DYSF exon 32 was based on the knowledge that a naturally occurring DYSF exon 32-excision led to mild LGMD2B in a patient that was ambulant until high age. AONs of the tricyclo-DNA backbone chemistry were applied, which due to the additional two carbon ring entities within the single nucleoside are more rigid and show higher binding affinity to RNA than DNA does. The in vitro and in vivo application of designed AON sequences corroborated findings of previous studies in which for particular exons masking of exon internal splice enhancer sequences induced exon exclusion most efficiently. Two of the designed exon internally binding AONs induced Dysferlin rescue in Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts.

Das cis-Spleißen von präkursor-mRNA (prä-mRNA) ist ein geeigneter Angriffspunkt für die Korrektur von Genen, deren Transkriptionsregulation, wie im Fall des dysferlin (DYSF) Gens, ausschlaggebend für die Funktionalität des enkodierten Proteins ist. Mutationen des DYSF Gens führen zu unterschiedlichen Arten der Muskeldegeneration, vorrangig zur Gliedergürteldystrophie des Typs 2B oder Muskeldystrophie Miyoshi 1. Es wurden zwei Strategien zur Modifikation des prä-mRNA cis-Spleißens zur DYSF RNA-Korrektur etabliert, das Spleißosom- vermittelte prä-mRNA trans-Spleißen durch ein technisiertes prä-mRNA trans- Spleißmolekül (PTM) und das Antisense-Oligonukleotid (AON)-induzierte Ausschneiden des DYSF Exons 32 aus der DYSF prä-mRNA . SmaRT mittels eines PTMs erlaubt das Ersetzen von umfagreichen Abschnitten der prä-mRNA und die Erhaltung des kompletten mRNA-Transkripts eines Gens. Dieser Ansatz eignet sich besonders zur Korrektur des DYSF Gens, da krankheitserregende Mutationen innerhalb des gesamten Leserahmens des Gens identifiziert worden sind und die Gen-Ersatz-Therapie durch Expression eines verkürzten Mini-Dysferlin die Muskeldegeneration nicht lindert. Für die Entwicklung einer effizienten SmaRT- Strategie ist der cis-Spleißprozess von DYSF prä-mRNA Introns, die unterschiedlich starke Spleißsignale aufweisen durch PTMs in humanen Dysferlin-defizienten Myoblasten angezielt worden. Diese Introns wurden durch PTMs mit unterschiedlichen prä-mRNA Bindedomänen angegriffen, um das PTM entweder in die Nähe des Intron internen 5’Spleißsignals zu bringen, oder um das Intron interne 3’Spleißsignal zu maskieren. Eine Modifikation des cis- Spleißens durch ein PTM war in Introns, die schwache Spleißsignale kodieren mittels eines PTMs, welches in der Nähe des 5‘ Spleißsignals und damit des aktivierten U1 snRNPs lokalisiert, am effizientesten. Das Trans-Spleißen von zwei der angezielten DYSF prä-mRNA Introns fuehrte zu einer Wiederherstellung der Dysferlinexpression im Dysf-/- Mausmodell. Eine Wiederherstellung des Dysferlin Proteins konnte jedoch nur in moderatem Mass detektiert werden, was an die geringe Effizienz von SmaRT-Strategien, die bereits für andere Gene entwickelt worden sind, erinnert. Allerdings konnten übereinstimmende Eigenschaften zwischen effizient angezielten DYSF Introns und Introns, die in zuvor entwickelten Strategien angezielten wurden, identifiziert werden, die eine systematische Auswahl der Zielintrons in zukünftigen SmaRT-Strategien erlauben könnten. Die Strategie des AON-vermittelten Ausschneidens des DYSF Exons 32 aus der prä-mRNA wurde vor dem Hintergrund entwickelt, dass ein natürlich vorkommendes Fehlen des DYSF Exons 32 in der prä-mRNA einer Patientin zu einer milden Gliedergürteldystrophie des Typs 2B führt. Es wurden AONs mit einem tricyclo-DNA-Rückgrat angewendet, welche durch die zwei zusätzlichen Kohlenstoffringeinheiten im einzelnen Nukleosid wenig elastisch sind und eine höhere Bindeaffinität als DNA gegenüber RNA-Molekülen zeigen. Die in vitro und in vivo Anwendung der AON-Sequenzen haben Ergebnisse voriger Studien bestätigt, in denen gezeigt wurde, dass das Ausschneiden von bestimmten Exons am effizientesten durch Maskierung exoninterner Spleißverstärkender Sequenzen erreicht werden kann. Zwei der entwickelten exonintern bindenden AONs haben zur Wiederherstellung der Translation des Dysferlin in humanen Dysferlin defizienten Myoblasten geführt.