The role of urinary peptide markers in diagnosis and prognosis of severe renal diseases

Abstract

Introduction: Early diagnosis and prognosis of kidney malfunction are of utmost interest for patient healthcare. Unfortunately, current clinical measurements and biochemical markers of the kidney function have provided the poor outcome of disease onset. Therefore, novel and more reliable biomarkers are needed to allow early risk stratification of the patients suffering from Autosomal polycystic kidney disease (ADPKD) and Acute kidney injury (AKI). With the usage of advances in mass spectrometry (MS)-based technology, screening of the urine proteome appears beneficial. Therefore, in this dissertation new and improved urinary peptide markers on different MS-based platforms were examined. Methods: Urine samples from healthy, ADPKD and AKI patients were measured to analyse low molecular weight proteome and to establish a multidimensional peptide marker panel. For this purpose, capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-MS), liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) and matrix-assisted laser desorption/ionization coupled to mass spectrometry (MALDI-MS) were applied. Results: In the first part of the thesis 20 urinary peptides were identified by comparison of ADPKD patients exhibiting a relatively stable renal function with those progressing to end stage renal disease (ESRD) and multidimensional marker panel was established. Applied to several validation cohorts the panel achieved an area under the curve (AUC) between 0.83 and 0.92. Based on peptide sequence information in silico prediction of several proteases that may drive ADPKD progression was assessed. In the second part, development of AKI classifier on MALDI MS-based platform was performed. This panel was generated by comparison of non-AKI and AKI patients, where 39 urinary peptide markers were selected. The performance of the peptide marker panel for early diagnosis of AKI was tested in the validation cohort and it achieved AUC 0.82. The last part of the thesis was defined to investigate high energy collision dissociation (HCD) and collision-induced dissociation (CID) high resolution MS/MS who provided superior results in quantification and identification of naturally occurring peptides (NOPs) in urine. In addition, they demonstrated improvement of the correct peptide marker hits used in clinical biomarker discovery. Conclusion: The limitations and increased non-effectiveness of quality management of patients in daily clinical practice, raise the possibility of proteomic analysis of urine to be utilized for routine health check-up providing earlier and more accurate identification of disease-related changes. The results of this thesis just demonstrated that mass spectrometry- based platforms could assist in better diagnostic and prognostic tests applicable for the clinical settings.

Einleitung: Eine frühzeitige Diagnose und Prognose von Nierenfunktionsstörungen ist für die Gesundheitsvor- und –fürsorge bei betroffenen Patienten von größtem Interesse. Die aktuellen klinischen Messungen und biochemischen Marker der Nierenfunktion sind dahingehend jedoch unzureichend. Daher sind neue und zuverlässigere Biomarker notwendig, um eine frühzeitige Risiko Stratifizierung z.B. von Patienten mit einer autosomal polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) oder akutem Nierenversagen (AKI) zu ermöglichen. Durch die technologischen und analytischen Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) erschien eine Untersuchung des Urinproteoms vorteilhaft. Aus diesem Grund wurden in diesem Promotionsvorhaben neue und verbesserte Urin-Peptidmarker auf verschiedenen MS-basierten Plattformen analysiert. Methoden: Die Urinproben von gesunden Personen sowie von ADPKD und AKI Patienten wurden massenspektrometrisch gemessen, um das niedrigmolekulare ( 20kDa) Proteom zu analysieren und multidimensionale Peptidmarkermuster zu etablieren. Hierzu wurden die direkt mit einer time-of-flight Massenspektrometrie gekoppelte Kapillarelektrophorese (CE-MS), die massenspektrometrie-gekoppelte Flüssigkeitschromatographie (LC-MS) und die matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation gekoppelte Massenspektrometrie (MALDI-MS) verwendet. Ergebnisse: Im ersten Teil der Arbeit wurden 20 Urinpeptide durch den Vergleich von ADPKD Patienten mit einer relativ stabilen Nierenfunktion mit Patienten mit einer Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD) identifiziert. Aus diesen wurde dann ein multidimensionales Markermuster erstellt. Dieses wurde auf mehrere Validierungskohorten angewendet und erreichte eine Fläche unter der Kurve (AUC) zwischen 0,83 und 0,92. Basierend auf Peptidsequenzinformationen erfolgte in silico die Vorhersage von mehreren Proteasen, die die Progression einer ADPKD vorantreiben könnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein auf einer MALDI-MS- Plattform basierender AKI Klassifikator entwickelt. Das dazugehörige Markermuster wurde durch den Vergleich von nicht-AKI und AKI Patienten erzeugt, wobei 39 Urin-Peptidmarker identifiziert wurden. Die Leistung dieses Peptidmarkermusters für eine frühzeitige Diagnose von AKI wurde in der Validierungskohorte getestet und erreichte eine AUC von 0,82. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine hochauflösende MS/MS basierend auf Hochenergie- Kollisions Dissoziation (HCD) und stoßinduzierte Dissoziation (CID) verwendet, um hervorragende Ergebnisse bei der Quantifizierung und Identifizierung von natürlich vorkommenden Peptiden (NOP) im Urin zu erreichen. Darüber hinaus zeigten diese Analysen eine Verbesserung bei den Treffern für korrekte Peptidmarker in der klinischen Biomarker-Identifizierung. Fazit: Die Möglichkeiten der der Proteom-Analyse in Urin im Rahmen einer Routinegesundheitsuntersuchung liegen in der Überwindung der begrenzten Effektivität und Wirksamkeit des momentanen Qualitätsmanagements z.B. bei ADPKD und AKI Patienten in der täglichen klinischen Praxis unter anderem durch die frühere und genauere Identifizierung von krankheitsbedingten Veränderungen. Die Ergebnisse dieses Promotionsvorhabens zeigen, dass die Analyse durch massenspektrometriebasierte Plattformen zu besseren diagnostischen und prognostischen Tests zur klinischen Patientenbeurteilung beitragen kann.