Isolierung, serumfreie Kultivierung und Phänotypisierung hepatischer Progenitorzellen aus humanen gesunden und zirrhotischen Resektaten

Abstract

Trotz des immensen Regenerationspotentials der Säugetierleber galt die Existenz adulter intrahepatischer Stammzellen lange Zeit als umstritten. Erst im Laufe der letzten 20 Jahre konnte die herausragende Rolle hepatischer Stamm- und Progenitorzellen bei der Leberregeneration nach chronischer Gewebeschädigung herausgearbeitet werden. Da dieses Wissen nahezu ausnahmslos im Tiermodell erworben wurde, bedurfte es einer Übertragung der Erkenntnisse auf den Menschen. Bisherigen Versuchen eines Nachweises von humanen Leberzellvorläufern waren primär aufgrund der Knappheit an Gewebe, des mangelhaft definierten Immunphänotyps und des vermutlich geringen Stammzellgehalts gesunder Lebern Grenzen gesetzt. Da die Untersuchung einiger chronischer Erkrankungen der Leber nahelegte, dass die Menge an Vorläuferzellen im Gewebe mit dem Grad der Schädigung korreliere, wurde die Hypothese aufgestellt, dass zirrhotische Lebern ethyltoxischer Genese ein Reservoir für hepatische Stamm- und Progenitorzellen darstellten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Möglichkeit zur Isolierung und Kultivierung hepatischer Progenitorzellen aus humanen gesunden und zirrhotischen Leberresektaten aufgezeigt. Mittels einer Kombination aus Kollagenase- Perfusion und Dichtegradientenzentrifugation ist es gelungen, aus 13 gesunden und 10 ethyltoxisch bedingten zirrhotischen Leberproben eine koloniebildende Zellpopulation anzureichern. Dabei fiel die Kolonieausbeute bei zirrhotischem Gewebe etwa 60-fach höher aus als bei gesunder Leber. Die Anzucht des gewonnenen Zelltyps erfolgte in vitro unter weitestgehend serumfreienBedingungen. Während Kolonien aus gesunden Lebern bis zu zwei Monate lang kultiviert werden konnten, überlebten solche aus zirrhotischen Lebern maximal zwei Wochen. Anhand von Zeitrafferaufnahmen und Bildersequenzen wurde proliferatives Wachstum der Zellen nachgewiesen und quantifiziert. Darüber hinaus konnte die Propagation durch Kokultur mit mesenchymalen Feederzellen erfolgreich demonstriert werden. Zur Bestimmung der Identität erfolgte die Phänotypisierung der Zellpopulation auf morphologischer, RNA- und Proteinebene. Hierfür wurde die Morphologie lichtmikroskopisch untersucht und die Gen- und Antigenexpression mit Hilfe von qualitativen RT-PCRs und Immunfluoreszenzfärbungen analysiert. Es ließen sich mit der Zellgröße von 6-12 µm, der hohen Kern-Plasma-Relation, dem ovalen Zellkern und den Kolonieformationen deutliche Analogien zu anderen in der Literatur beschriebenen Vorläuferzellen der Leber feststellen. Ferner wies die simultane Expression von Markern für Stammzellen (EpCAM, NCAM), Hepatozyten (Albumin, Transferrin, HNF-4α, CYP3A4, Connexin 32) und Cholangiozyten (CK19) auf eine Mittel¬stellung des Zelltyps zwischen diesen Differenzierungsgraden hin. Ein solcher intermediärer Phänotyp wird in einschlägigen Publikationen oftmals Vorläuferzellen der Leber zugeordnet. Es wurde schließlich gefolgert, dass es sich bei der isolierten Zellpopulation um hepatische Progenitorzellen handeln musste. Die beträchtliche Kolonieausbeute aus zirrhotischen Leberteilresektaten spiegelt einen außerordentlichen Gehalt an hepatischen Progenitorzellen im Gewebe wider. Damit würde sich eine Nutzung des chronisch geschädigten Gewebes zur Gewinnung dieser Zellen für klinische oder wissenschaftliche Zwecke anbieten. Mit der serumfreien Kultivierbarkeit, der Klonalität und der Propagierbarkeit erfüllen hepatische Progenitorzellen entscheidende Voraussetzungen für den potentiellen Einsatz in regenerativen Verfahren wie autologer Zelltherapie und bioartifiziellen Leberunterstützungssystemen. Auf diese Weise könnten sie in absehbarer Zeit zur Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien bei akuter und chronischer Leberinsuffizienz beitragen, deren einzige kurative Therapieoption derzeit die orthotope Lebertransplantation darstellt. Darüber hinaus wären Progenitorzellen für Gentherapie, Grundlagenforschung und bei gezielter Differenzierung auch für Toxizitätsmodelle von Pharmaka eine attraktive Ressource. Bevor jedoch eine klinische Anwendung in Erwägung gezogen werden kann, bedarf es weiterer Untersuchungen, deren Fokus auf die Optimierung von Expansion und Kultivierung gerichtet sein sollte; nur so können adäquate Zellmengen für eine umfassende funktionelle Charakterisierung sowie für in vivo Studien zur Abschätzung der Risiken und der Repopulationsfähigkeit hepatischer Progenitorzellen sichergestellt werden.

Despite the extraordinary regenerative capacity of the mammalian liver, the existence of adult intrahepatic stem cells has been controversively discussed for a long time. It was only in the last 20 years that the explicit role of hepatic stem and progenitor cells in liver regeneration after chronic tissue damage has become evident. Since this knowledge has been primarily acquired by animal models, it was necessary to translate these findings to human beings. Former approaches in providing evidence for actual existence of human intrahepatic progenitor cells have been limited by scarcity of tissue, their poorly defined immunophenotype and the presumably low content of stem cells in healthy liver. Due to studies on chronically diseased livers suggesting a positive correlation between the amount of progenitor cells and the degree of damage, it was hypothesized that alcohol-related cirrhotic livers could represent a reservoir of hepatic stem and progenitor cells. In this study we showed a method, which makes isolation and cultivation of hepatic progenitor cells from human healthy and cirrhotic liver specimens possible. We succeeded in enriching a colony forming cell population from 13 healthy and 10 cirrhotic liver specimens using a combination of collagenase perfusion technique and density gradient centrifugation. Hereby, we saw a 60-fold higher colony yield from cirrhotic tissue compared to healthy liver. We performed in vitro cultivation of the cell type under nearly serum-free conditions. Whereas colonies extracted from healthy livers could be cultivated up to two months, those from cirrhotic livers survived for two weeks at most. By means of time lapse photography and image sequences we proved and quantified proliferative activity of the cell type. Furthermore, we demonstrated propagation of the cell type by cocultivation with mesenchymal feeder cells. We defined the phenotype on morphologic, molecular and protein level. Thus, we examined the morphology via light microscopy and analyzed the expression of genes and antigens by qualitative RT-PCRs and immunofluorescence staining. We found distinct similarities to other described progenitor cell types of the liver, such as typical cell size (6-12 µm), high nucleus-to-cytoplasm ratio, oval nucleus and characteristic colony form. Moreover, the simultaneous expression of markers for stem cells (EpCAM, NCAM), hepatocytes (albumin, transferrin, HNF-4, CYP3A4, connexin 32) and cholangiocytes (CK19) indicated a medial position between these stages of maturity. This intermediate phenotype has often been associated with progenitor cells of the liver. Therefore, we concluded that the isolated cell population was indeed a hepatic progenitor cell population. The considerable colony yield from cirrhotic livers reflects the extraordinary content of hepatic progenitor cells in this tissue. Thereby, chronically damaged tissue might be an appropriate source of these cells for clinical and scientific purposes. Being cultivable under serum-free conditions, showing clonality and propagability, hepatic progenitor cells fulfill critical requirements for potential appliance in regenerative technologies such as autologous cell transplantation and bioartificial liver assist devices. Thus, they could contribute to development of alternative strategies for treating acute and chronic liver failure in near future, where currently orthotopic liver transplantation remains the only curative therapy option. Furthermore, hepatic progenitor cells might be an attractive resource for gene therapy, basic research and after directed differentiation for pharmacologic toxicity screenings. However, prior to consideration for clinical application, more studies are necessary, where the primary focus is on optimization of expansion and cultivation; following this approach it could be possible to achieve adequate cell amounts for an extensive functional characterization and for in vivo studies aiming at assessment of risks and repopulation capacity of the hepatic progenitor cells.