In situ Lokalisation und Diskriminierung von pathophysiologischen Regionen in traumatisierter Skelettmuskulatur mit Hilfe von bildgebender Massenspektrometrie

Abstract

Zielsetzung: Verletzungen der Skelettmuskulatur sind sehr häufig, da sie nicht nur direkt aus einer Verletzung resultieren, sondern auch durch iatrogene Beschädigungen des Muskels während verschiedener operativer Eingriffe (z.B. Hüft- bzw. Knie-Ersatz- Operationen) hervorgerufen werden. Die begrenzte Regenerationsfähigkeit des verletzen Muskels schränkt die generelle Funktion des Gewebes ein und führt dadurch zu unbefriedigenden Heilungsergebnissen bei den betroffenen Patienten. Gegenwärtig gibt es keine Behandlungsansätze in der klinischen Anwendung, welche die Regeneration von kontraktilem Muskelgewebe ermöglichen. In Vorarbeiten konnten wir jedoch im Tiermodellen und im Menschen zeigen, dass Zell-basierte Strategien in der Lage sind die Regeneration von verletztem Skelettmuskel substantiell zu verbessern. Neben einem unvollständigen Verständnis der exakten Mechanismen durch welche die verwendeten Zellen die Muskelfunktion wiederherstellen, besteht ein Mangel an verlässlichen Markern zur akkuraten Unterscheidung der verschiedenen pathologischen Regionen innerhalb des verletzten Muskels. Solche Marker (Demonstratoren) sind eine der Schlüsselvoraussetzungen für die Weiterentwicklung, die Stratifizierung und für das Monitoring der Wirksamkeit unserer experimentellen Zell-basierten Therapien zur Verbesserung der Muskelheilung.Non-target–Proteomanalysen, wie beispielsweise 2D- Gelelektrophorese (2DE) oder Flüssigkeitschromatographie (LC) basierter Massenspektrometrie (MS), sind ein viel versprechender Ansatz zur Identifizierung von neuen therapeutischen Targets und Markern zur Charakterisierung von pathophysiologische Prozessen. Allerdings ermöglichen diese Methoden nicht die räumliche Unterscheidung der pathophysiologischen Regionen. Die in situ Analyse, mittels kombinierter non-target Proteomanalyse und bildgebender Massenspektrometrie, erscheint daher ein vielversprechender Ansatz für die Identifizierung neuer Marker für die Lokalisation der unterschiedlichen pathologischen Regionen in traumatisierten Skeletmuskulatur zu sein. Experimentelles Design: Mit Hilfe der (i) bildgebenden Massenspektrometrie auf Basis der Matrix-unterstützten Laser- Desorption/Ionisation (MALDI Imaging), zur direkten (in situ) Analyse von Proteinen/Peptiden im Gewebe, und (ii) komplementärer bottom-up Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur die Proteinidentifizierung, wurden die charakteristischen pathophysiologischen Veränderungen in Formalien-fixiertem und Paraffin eingebettetem verletzten Skelettmuskulatur untersucht (Tiermodel; Ratte). Identifizierte charakteristische Proteinmarker wurden anschließend mittels Immunhistologischer Färbung validiert. Ergebnisse: Alpha skeletal muscle actin (Acts) und Carbonic anhydrase 3 (Ca3) wurden als vielversprechende neue Biomarker für die Diskriminierung der pathophysiologischen Regionen, Trauma und Trauma umgebenden Gewebe, identifiziert und validiert.

Purpose: Skeletal muscle injuries are extremely common, since they do not only result directly from an injury, but also from iatrogenic muscle damage enduring various surgical procedures (e.g. hip or knee replacement surgery). The limited regeneration of the injured skeletal muscle is clinically challenging, compromises the general tissue function and results in unsatisfying outcome for the affected patients. To date, no treatment approach exists in clinical use, which allows the regeneration of contractile muscle tissue. However, our previous work demonstrates that cell-based strategies are able to enhance the regeneration of skeletal muscle in animal models and humans. A part from an incomplete understanding of the exact mechanisms by which specific cells promote restoration of skeletal muscle function; there is a lack of reliable markers to discriminate accuraty the different pathophysiological regions within the injured muscle. Such markers are one key requirement for the further development, risk stratification, and the monitoring of efficacy of experimental cell-based therapies aiming to enhance muscle healing. Non-targeted proteome methodologies, such as gel- electrophoresis (2DE) or liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS), are promising to reveal new pathophysiological-related markers and therapeutic targets. However these methodologies give little knowledge about the actual spatial distribution of pathophysiological changes. Therefore, in situ analysis, by using a combination of non-targeted proteomic approaches and imaging mass spectrometry, seems to be a promising approach to identify such novel markers for the localization of the different pathophysiological regions in traumatized skeletal muscle. Experimental design: Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) for direct (in situ) peptide signature analysis and subsequent bottom-up mass spectrometry (LC-MS/MS) were used to identify proteins, which describing the spatial characteristics of pathophysiological changes in injured rate skeletal muscle tissue. The results were validated by immunohistochemistry staining. Results: Alpha skeletal muscle actin (Acts) and carbonic anhydrase 3 (Ca3) were identified and validated as promising novel biomarkers to discriminate the primary trauma and trauma adjacent region within the muscle tissue.Conclusions and clinical relevance: This is the first study showing that tissue-based proteomic profiling by the non-target approaches MALDI-IMS and subsequent“bottom up” LC −MS/MS analysis is a suitable method to identify proteomic (bio) markers and to discriminate pathophysiological alterations between the primary trauma and trauma adjacent muscle. We propose that the presented workflow provides the basis for monitoring and stratification of (cell-based) therapeutic approaches aiming to improve muscle healing.