Subzelluläre Lokalisation von MICA in Abhängigkeit vom MICA-Genotyp bei Zöliakie

Abstract

Einleitung: Zöliakie ist eine systemische, durch Gluten ausgelöste Immunerkrankung, die sich mit einem Malabsorptionssyndrom, aber auch mit vielfältigen Symptomen in nahezu allen Organen manifestiert und mit einer Prävalenz von etwa 1 % in der kaukasischen Bevölkerung auftritt. MICA, ein atypisches MHC-Klasse-I-Molekül, spielt eine tragende Rolle in der Pathogenese der Zöliakie, indem es als Ligand für intraepitheliale Lymphozyten, die bei der Erkrankung vermehrt in das Dünndarmepithel einwandern, zur Zelllyse und damit zu der zöliakietypischen Zottenatrophie beiträgt. Einige MICA-Allele, zusammengefasst als MICA-A.5.1-Allele, tragen eine Guanininsertion, die in einer Trunkierung der Transmembrandomäne resultiert und in MDCK-Zellen zu einer Sortierung in die apikale anstatt in die basolaterale Membran führt. Methoden: Zöliakiepatienten und Kontrollen wurden mittels DNA-Sequenzierung auf das Vorliegen der MICA-A5.1-Allele untersucht. Anhand von Patienteninterviews wurde die klinische Präsentation der Zöliakie analysiert und mit dem MICA-Genotyp korreliert. Die Lokalisation von MICA wurde in Duodenalbiopsien der sequenzierten Patienten spezifisch mit Immunhistochemie dargestellt. Mit Immunfluoreszenzfärbungen an Biopsien und Caco-2-Zellen wurde die subzelluläre Lokalisation von MICA und MICB, einem nahezu sequenzhomologen Protein, untersucht. In Western-Blot-Analysen wurden die MICA/B-Proteinlevel von Patienten mit Zöliakie und refraktärer Zöliakie sowie Kontrollen verglichen. Ergebnisse: Bei Zöliakiepatienten liegt das Allel A5.1 signifikant häufiger vor als bei Kontrollen, immunhistochemisch zeigte sich bei A5.1-positiven Patienten eine Sortierung von MICA in die apikale Membran. Eine Auswirkung auf die klinische Präsentation der Zöliakie bestätigte sich nicht. In Duodenalbiopsien fand sich bei allen Individuen ein apikales Immunfluoreszenzsignal von MICA und MICB unabhängig vom MICA-Genotyp, das mit alkalischer Phosphatase, rab3b-positiven Vesikeln und IgA enthaltenden Strukturen kolokalisiert. In MICA-Allel-A5.1-negativen Caco-2-Zellen zeigte sich ebenfalls eine apikale MICA/B-Fraktion, die mit alkalischer Phosphatase, aber auch mit Lipid rafts kolokalisiert. Die intrazellulär vorliegende MICA/B-Fraktion konnte keinem untersuchten Zellkompartiment zugeordnet werden. In Western-Blot-Analysen bestätigte sich eine gesteigerte Expression von MICA/B nur in Patienten mit refraktärer Zöliakie gegenüber Kontrollen. Unabhängig vom Genotyp zeigte sich eine kleinere, 38 anstatt 43 kDa große MICA/B-Fraktion. Schlussfolgerung: Die MICA-A5.1-Allele scheinen bei Kontrollen und Patienten eine Sortierung von MICA in die apikale Membran ohne Auswirkung auf die klinische Präsentation der Zöliakie zu bewirken. Die jedoch in allen Gruppen beobachtete apikale Lokalisation von MICA und MICB und die Kolokalisation mit sekretorischen Strukturen und Lipid rafts deuten auf eine zusätzliche Funktion von MIC-Proteinen neben der Interaktion mit den intraepithelialen Lymphozyten hin. Die im Western-Blot beobachtete, vom Genotyp unabhängige 38 kDa große MICA/B-Fraktion ist möglicherweise ein Hinweis auf eine posttranslationale Prozessierung der Proteine. Um diese Hypothesen zu untersuchen, wären als Gegenstand weiterer Studien funktionelle Analysen von MICA und MICB vonnöten, um z.B. eine luminale Sekretion näher beleuchten zu können.

Introduction: Celiac disease is a systemic immune disease induced by gluten which causes a malabsorption syndrome, but also manifests with many symptoms in almost all organ systems. The prevalence is about 1 % in the Caucasian population. MICA, an atypical MHC class I molecule, plays an important role in disease pathogenesis by acting as a ligand for intraepithelial lymphocytes, which in celiac disease infiltrate small intestine epithelium leading to cell lysis and thereby causing villous atrophy typical of the disease. There are four MICA alleles, collectively, MICA A5.1 alleles, carrying a guanine insertion leading to a truncation of the protein within the transmembrane domain. In MDCK cell lines this results in sorting of MICA to the apical instead of the basolateral cellular membrane. Methods: By DNA sequencing, celiac disease patients and healthy controls were tested for the presence of MICA A5.1 alleles. Patients were interviewed to analyze the disease’s clinical presentation in each individual; the results were correlated with the respected MICA genotype. MICA localization in duodenal biopsies was shown by immunohistochemistry staining. Subcellular localization of MICA and MICB, a protein almost homologue to MICA in structure and sequence, was analyzed in human duodenal biopsies and Caco-2 cell lines by immunofluorescence staining. Western blot analysis was performed in celiac disease and refractory celiac disease patients and in controls to compare MICA/B protein levels. Results: MICA alleles A5.1 are significantly higher in patients with celiac disease than in controls. Immunohistochemistry showed an apical sorting of MICA in patients carrying MICA A5.1. There was no indication that apical MIC-A does affect clinical presentation of the disease. An apical immunofluorescence staining of MICA and MICB together was found in all human duodenal biopsy samples, in both MICA A5.1 positive and negative patients, and co-localized with alkaline phosphatase, rab3b-positive vesicles and IgA-containing structures. Furthermore, MICA A5.1 negative Caco-2-cells showed this apical staining signal as well; in this case immunofluorescence revealed a co- localization of MICA/B not only with alkaline phosphatase, but with lipid rafts. The cell compartment holding intracellular MICA/B could not be identified. Western blot analysis showed higher expression levels of MICA/B in refractory celiac disease patients compared with controls only. An amount of MICA/B with a molecular weight of 38 kDa instead of 42 kDa was found in both MICA A5.1 positive and negative samples, regardless of MICA genotype. Conclusion: MICA A5.1 alleles appear to cause MICA shifting in the apical membrane without affecting clinical presentation in celiac disease. Apical localization of MICA and MICB and their co-localization with secretory structures and lipid rafts observed in all samples indicate an additional function of MICA/B other than acting as a ligand only. The amount of 38 kDa- MICA/B might suggest posttranslational modification of MICA/B proteins. In order to test these hypotheses, further functional studies, for example luminal secretion of MICA/B, have to be performed.