Developing quantitative GTPase affinity purification (qGAP) to identify interaction partners of Rho GTPases

Abstract

Rho GTPases are central regulators of the actin cytoskeleton. Additionally, they have influence on gene expression, cell division and other biological processes. Classical Rho GTPases function as molecular switches, being active when GTP is bound and inactive in the GDP-bound state. The exchange of nucleotides, the GDP/GTP cycle, is subject to intense regulation. The multiple biological activities of Rho GTPases are mediated by numerous downstream effector proteins. However, a systematic experimental comparison of Rho GTPase interaction partners has not been performed. This thesis describes development, validation and biological outcome of a new method to identify Rho GTPase effector proteins for both of the nucleotide-loaded forms. We named this assay quantitative GTPase affinity pull-down (qGAP). qGAP combines affinity purification with quantitative mass spectrometry. Recombinant Rho GTPases were purified and loaded with either GDP or GTPγS. The Rho GTPases were covalently coupled to a sepharose matrix and used for affinity purification. Quantitative shotgun proteomics was then used to compare the abundance of proteins interacting with the GDP- and GTPγS-loaded forms, to identify loading state-specific binders. First, qGAP was applied to RhoA, Rac1 and Cdc42 to identify binding partners from cytoplasmic extracts of SILAC- labeled HeLa cells (SILAC-qGAP). Next, lysates from mouse brains were used to identify interaction partners of RhoA, RhoB, RhoC, RhoD, Rac1 and Cdc42 using label free quantification (LF-qGAP). In both variants of qGAP, groups of specific binders could be distinguished from hundreds to thousands of background binders. Interaction partners identified by qGAP where highly enriched with known Rho interaction partners when compared to an unbiased reference database. For LF-qGAP, the sensitivity was good (50%) and the specificity excellent (97%). If further studies show, that the newly identified interaction partners are true, the real sensitivity might be higher. Hierarchical clustering of biological replicate samples showed that qGAP data was highly reproducible. In total, LF-qGAP identified 291 mostly novel interactions. Eleven out of twelve tested novel interactions were confirmed by a newly developed, independent assay. From the binding data a comprehensive Rho interaction network was constructed. We found the promiscuousness of binding partners to be higher than anticipated. The overlap allowed us to deduce similarities between the network and the phylogeny of Rho GTPases. Altogether, these data show that qGAP is a valuable novel method to study Rho GTPase biology.

Rho GTPasen stellen zentrale Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts dar. Zusätzlich können sie die Genexpression, Zellteilung und andere biologische Prozesse beeinflussen. Die klassischen Rho GTPasen sind molekulare Schalter. Wenn sie GTP gebunden haben befinden sie sich im aktiven, bei Bindung von GDP im inaktiven Zustand. Der Austausch dieser beiden Nukleotide, auch GDP/GTP- Zyklus genannt, wird streng reguliert. Die vielfältigen biologischen Aktivitäten der Rho GTPasen werden durch zahlreiche Effektoren vermittelt. Trotz ihrer Wichtigkeit wurde eine systematische Untersuchung dieser Interaktionspartner noch nicht durchgeführt. In dieser Doktorarbeit sind die Entwicklung, die Validierung und die biologischen Ergebnisse einer neuen Methode zur Identifizierung von Rho GTPase Effektoren beschrieben. Diese Methode wurde von uns „quantitative GTPase affinity pull-down“ (quantitativer GTPasen Affinitäts Pulldown, qGAP) genannt. qGAP vereinigt die Affinitäts- Aufreinigung (Pulldown) mit quantitativer Massenspektrometrie. Dabei werden beide Nukleotid-Ladungszustände berücksichtigt. Zu diesem Zweck wurden rekombinante Rho GTPasen aufgereinigt und entweder mit GDP oder GTPγS geladen. Die Rho GTPasen wurden kovalent an eine Sepharose Matrix gekoppelt und für Affinitätsaufreinigung eingesetzt. Quantitative shotgun proteomics wurde verwendet, um die Menge von Proteinen zu vergleichen, die mit der GDP- und GTPγS-geladenen Form interagiert haben. Dadurch wurden Ladungs-spezifische Bindungspartner identifiziert. Zunächst wurde qGAP mit RhoA, Rac1 und Cdc42 auf zytoplasmatische Extrakte von SILAC-markierten HeLa Zellen angewendet (SILAC-qGAP). Im nächsten Schritt wurden Lysate von unmarkierten Maus Gehirnen verwendet um Interaktionspartner von RhoA, RhoB, RhoC, RhoD, Rac1 und Cdc42 zu identifizieren (LF-qGAP). In beiden Varianten von qGAP konnten Gruppe von spezifischen Interaktionspartnern klar von hunderten bis tausenden von Proteinen unterschieden werden. Durch den Vergleich mit einer Interaktionsdatenbank wurde festgestellt, dass diese spezifischen Interaktionspartner klar mit bekannten Rho Effektoren angereichert waren. Für LF-qGAP war die Sensitivität gut (50%) und die Spezifizität exzellent (97%). Falls weitere Studien zeigen, dass die neuen Interaktionspartner wahr sind, könnte die tatsächliche Sensitivität höher liegen. Eine hierarchische Clusteranalyse der biologischen Replikate ergab, dass qGAP sehr reproduzierbar war. Insgesamt wurden mit qGAP 291, größtenteils neue Interaktionspartner identifiziert. Elf von zwölf getesteten neuen Interaktionen wurden durch eine neu entwickelte, unabhängige Methode validiert. Die Bindungsdaten wurden verwendet um ein umfassendes Rho Interaktionsnetzwerk zu erstellen. Es wurde eine höhere Promiskuität zwischen Bindungspartnern gefunden als zuvor vermutet. Das Überlappen von Bindungspartnern erlaubte uns auf Ähnlichkeiten zwischen dem Netzwerk und der Stammesgeschichte der Rho-GTPasen zu folgern. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass qGAP eine wertvolle neue Methode zum Studium der Rho GTPasen Biologie darstellt.