Novel Polymerase Inhibitors: Characterisation of a Nanocarrier and Activity Testing in a 3D Non-Melanoma Skin Tumour Model

Abstract

Cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant epidermal keratinocyte tumour, also characterised by its invasion into the dermis. Actinic keratosis (AK) is a precursor stage of SCC, now generally considered to be a carcinoma in situ that should be treated. However, shortcomings in current therapies including pain and unsatisfactory cure rates have raised the need for new treatment options, specifically targeting the tumour lesions. Recently, a set of promising DNA polymerase α inhibitors have been identified by molecular modelling and ligand docking. Two molecules (OxBu and OxHex) were identified as most selective and potent in vitro monolayer culture with activity exceeding that of 5-FU and aphidicolin 1000 fold. However, their poor solubility and a relatively large molecular weight (>400 Dalton), make them less favourable for skin penetration and challenging for topical application. In order to enable the detection of OxBu and OxHex and their active metabolites, an HPLC method was established and validated. Next, a modified solid lipid nanocarrier system was developed which included DMSO as solubiliser to enable drug incorporation into the lipid matrix. Applying hot homogenisation, SLN with an average size < 200 nm and good drug entrapment (96%) within the lipid matrix were obtained. Long term physical stability for drug loaded SLN was found to be highest at 5°C, using lipid concentrations of 3.5%. In view of a potential dermal application, the developed SLN were incorporated into a hydrogel, as an approach to prevent agglomeration and further improve the physical stability of the nanoparticles. During the course of this work, OxBu emerged as the most promising candidate and became the main focus of this thesis. To be able to closely simulate the in vivo situation as well as to better evaluate the efficacy of the novel drug and the developed carrier system, OxBu activity was tested using a three dimensional human skin tumour construct which has previously been characterised and validated for photodynamic therapy of SCC. The results obtained by immunohistochemistry on treated tumour constructs showed 0.05% OxBu solution to be at least as active as 5% 5-FU (Efudex cream) when applied twice within 5 days. The tumour model was then further adapted to mimic AK more closely, before being used to evaluate the therapeutic effect of OxBu in the context of the new carrier system. Qualitative parameters obtained by further immunohistochemistry experiments were used to characterise models and describe their homology to the in vivo situation. To this end, a series of markers, indicating keratinocyte proliferation (Ki67), metastasis development (MMP2), SCC growth (cytokeratin, AxL), and apoptosis (caspase 7) was studied. Treatment with OxBu and especially OxBu loaded SLN led to marked changes in the signal intensity of these markers that were more pronounced than those observed with 5-FU. As quantitative read out parameters to monitor response to therapy after topical treatment, the level of p53 as well as the level of cytokeratin 18 (apoptosis and necrosis marker) and its caspase cleaved fragments (apoptosis marker) were measured using ELISA. The results obtained suggest that apoptosis is the more dominant mode of cell death in OxBu treated models, continuously increasing over the first 7 days of treatment. In contrast, necrosis seems to be more dominant in case of 5-FU treatment, as indicated by the ratio of caspase cleaved to non cleaved cytokeratin 18 in the culture medium. Taken together, in the framework of the present work, a modified SLN formulation as carrier system for the novel guanosine phosphonate analogue OxBu was optimised and studied for its stability. Furthermore, the efficacy of the loaded and unloaded dug was studied in vitro in a 3D non melanoma skin tumour model, showing that the novel molecule is a promising candidate for the development of an improved topical therapy of actinic keratosis and skin cancer.

Das kutane Plattenepithelkarzinom (Squamous Cell Carcinoma oder SCC) ist ein maligner Keratinozytentumor, der auch durch deren Eindringen der transoformierten Zellen in die Lederhaut charakterisiert ist. Aktinische Keratose wird meist als Frühstadium des Plattenepithelkarzinom oder fakultative Präkanzerose betrachtet und sollte behandelt werden. Da aktuelle Behandlungen zu oft unerträgliche Schmerzen bei mäßigem Behandlungserfolg verursachen, besteht der Bedarf nach neuen, speziell auf die Läsion abzielender Therapien. Durch molekulare Modellierung wurde vor kurzem eine Gruppe Erfolg versprechender DNS-Polymerase α hemmender Moleküle entwickelt. Die beiden Vertreter OxBu und OxHex zeigten in Zellkulturversuchen eine 1000 Mal höhere Selektivität und Effektivität als 5-FU and Aphidicolin. Die schwere Lösbarkeit und das relativ hohe Molekulargewicht (>400 Dalton) erschweren aber deren Eindringen in die Haut und somit ihre Nutzung für die topische Anwendung. Um den Nachweis von OxBu und OxHex, sowie deren Metaboliten zu ermöglichen, wurde zunächst eine HPLC Methode etabliert und validiert. Danach wurde eine Lipidnanopartikel (Solid Lipid Nanocarrier - SLN) Nanodispersion entwickelt und OxBu sowie OxHex mit Hilfe des Lösungsmittels DMSO in die Lipidmatrix integriert. Durch eine Hitzehomogenisierung wurden eine Partikelgröße unter 200 nm und ein guter 96% Wirkstoffeinschluss in der Lipidmatrix erzielt. Die größte Langzeitstabilität der Pharmakon beladenen SLN wurde bei 5°C und Benutzung einer Lipidkonzentration von 3.5% gemessen. Hinsichtlich einer angestrebten dermalen Anwendung wurden die erstellten SLN in ein Hydrogel integriert, um Partikelagglomeration zu verhindern und die Stabilität der Nanopartikel weiter zu verbessern. Im Laufe dieser Arbeiten stellte sich OxBu als der vielversprechendere Wirkstoff heraus und wurde daher zum Fokus der weiteren Versuche in dieser Doktorarbeit. Um die realen Bedingungen in der Haut in vivo best möglich zu simulieren und dadurch die Wirksamkeit des potentiellen neuen Pharmakons und des Wirkstoff-Trägersystems zu bestimmen wurde der Effekt von OxBu an einem dreidimensionalen Hautkrebsmodel getestet, das für die Evaluierung von photodynamischen Therapiemethoden des SCC entwickelt und validiert worden war. Die mittels immunhistochemischer Methoden erzielten Ergebnisse eines behandelten Krebsmodells legen nahe, dass bei zweimaliger Applikation in 5 Tagen, 0,05% OxBu Lösung mindestens genauso aktiv ist wie 5% 5-FU. Das Hautkrebsmodel wurde daraufhin angepasst um eher AK zu simulieren, bevor mit ihm die Wirksamkeit von OxBu in Verbindung mit dem dafür entwickelten Trägersystem bestimmt wurde. Um anhand qualitative Parameter die Homologie des Krebsmodels mit der in vivo Situation zu Vergleichen wurden weitere immunhistochemische Methoden angewandt. Hierzu wurde eine Reihe von spezifischen Markern verwendet, die Aufschluss über das Auftreten von Keratinozyten-Proliferation (Ki67), Metastasierung (MMP2), Plattenepithelkarzinom-Wachstum (Cytokeratin, AxL) und Apoptose (Caspase 7) geben. Die Behandlung mit OxBu und insbesondere mit der OxBu-SLN Präparation führte zu auffälligen Veränderungen in der Signalstärke dieser Marker, die nach einer 5-FU Behandlung weniger stark so ausgeprägter waren. Als quantitative Messgrößen zur Bestimmung der Pharmakonwirkung wurden der p53- und sowohl Cytokeratin 18 als auch der Caspase 7 abgebaute Cytokeratin 18- Fragmentgehalt mit einem ELISA-Verfahren gemessen. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Wirkung von OxBu an den Krebsmodellen hauptsächlich auf Apoptose vermitteltem Zelltod basiert und sieben Tage nach Behandlungsbeginn maximal ist. Im Gegensatz dazu weist der Quotient von Caspase abgebaut zu natives Cytokeratin 18 darauf hin, dass die in diesen Modellen gezeigte Wirkung von 5-FU eher auf Nekrose beruhte. Zusammengefasst wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte Lipidnanopartikel-Dispersion als Wirkstoff-Trägersystem für das Guanosine-Phosphonate-Analogon OxBu optimiert und seine Stabilität getestet. Des Weiteren wurde die Wirkung des gelösten und in SLN integrierten Pharmakons in vitro an einem 3D nicht- melanozytären Tumormodel des hellen Hautkrebs getestet und gezeigt, dass die neue Substanz ein aussichtsreicher Kandidat für die Entwicklung einer verbesserten topischen aktinischen Keratose- und SCC Therapie ist.