The Autopalmitoylated Vesicular Transport Protein Bet3: Biochemical and Fluorescence-based Characterization of Membrane and Substrate Binding

Abstract

In eukaryotic cells the transport along secretory and endocytic pathways is performed by vesicular carriers. The initial attachment of a vesicle to the target membrane is called tethering. In case of ER-to-Golgi transport this step is performed by the TRAPP (transport protein particle) complex. The subunit Bet3 is present twice in the complex. It is thought that TRAPP performs its tethering function by interaction of Bet3 either with the vesicle’s coat proteins or with the organelle membrane. The crystal structure of Bet3 shows a hydrophobic tunnel, in which a palmitate chain is embedded. The palmitate is covalently attached via a thioester bond to a fully conserved cysteine (C68) located at the entrance of the tunnel. Several mechanisms for membrane binding of Bet3 have been suggested: the insertion of the covalently bound palmitoyl chain into the lipid bilayer of the membrane or the insertion of an acyl chain from a membrane lipid into the hydrophobic tunnel, and thirdly electrostatic binding via a positively charged patch on the Bet3 surface. Furthermore, binding could occur through interaction with a protein in the organelle membrane. Using LUVs (large unilamellar vesicles) as protein- free membrane models, it could be shown that no additional protein is needed to achieve transient membrane binding of human Bet3. Bet3 mutants without C68, with a blocked tunnel or without the positively charged patch all showed slightly reduced membrane binding, but neither mutation completely abolished it. It is therefore proposed that the binding of Bet3 is mediated by several weak interactions which in combination achieve a strong interaction force. In addition, the influence of membrane composition was investigated. Bet3 showed the strongest interaction with LUVs containing 10 % cholesterol whereas 40 % cholesterol strongly reduced membrane binding. In the presence of palmitoyl- CoA Bet3 is acylated by an autocatalytic SN2 mechanism at C68. Through a fluorescence quenching assay, it could be shown that Bet3 binds long chain fatty acid CoAs in micromolar range, whereas short chain fatty acid CoAs show only weak ligand binding in the millimolar range. In addition, three substrate binding sites have been identified: one inside the hydrophobic tunnel which is required for self-palmitoylation, and two additional hydrophobic patches located near the tunnel entrance on the protein surface. It is suggested that these external binding sites could help to extract Pal-CoA from the organelle membrane. Surface bound Pal-CoA might then be transferred into the tunnel by conformational change.

In eukaryontischen Zellen erfolgt die Beförderung von Proteinen entlang sekretorischer und endozytischer Transportwege durch Membranvesikel. Der Erstkontakt zwischen Vesikel und Zielmembran wird durch sogenannte Tether vermittelt, im Falle das ER-Golgi-Transports durch den TRAPP (transport protein particle) Komplex. Die Untereinheit Bet3 kommt an beiden Enden des TRAPP Komplexes vor und erkennt auf der einen Seite die Vesikel durch Interaktion mit ihrem Proteinmantel, während es vermutlich gleichzeitig auf der anderen Seite den TRAPP Komplex an die Zielmembran bindet. Bet3 wird von einem hydrophoben Tunnel durchzogen, in welchem eine Palmitylfettsäure eingebettet ist. Diese ist über eine Thioesterbindung kovalent an ein konserviertes Cystein (C68) gebunden, welches am Tunneleingang lokalisiert ist. Es wurden mehrere Mechanismen für die Membranbindung von Bet3 vorgeschlagen. Neben der Interaktion mit einem membranständigen Protein ist es denkbar, dass die Palmitylkette aus dem Tunnel herausklappt und sich in die Lipiddoppelschicht der Membran einlagert und/oder dass eine Fettsäurekette aus der Lipidschicht im hydrophoben Tunnel bindet. Desweitern verfügt Bet3 über einen positiv geladenen Bereich auf der Oberfläche, der über elektrostatische Wechselwirkung an die Membran binden könnte. Experimente mit LUVs (large unilamellar vesicles) als proteinfreien Membranmodellen zeigten, dass Bet3 dynamisch ohne die Mitwirkung eines zusätzlichen Proteins direkt an die Lipiddoppelschicht binden kann. Mutanten, in denen jeweils einer der genannten Bindungsmechanismen unterdrückt war, zeigten alle eine reduzierte Bindung. Jedoch konnte keine der Mutationen die Membranbindung vollständig unterbinden. Es ist daher anzunehmen, dass die Membranbindung durch die synergistische Verstärkung mehrerer schwacher Wechselwirkungen hervorgerufen wird. Zudem wurde der Einfluss der Membran-zusammensetzung untersucht. LUVs mit 10 % Cholesterol zeigten die stärkste Bindung, während bei LUVs mit 40 % Cholesterolgehalt die Membranbindung stark geschwächt war. Bet3 wird durch Pamityl-CoA über einen autokatalytischen SN2-Mechanismus an C68 acyliert. Mit Fluoreszenzquenchingexperimenten konnte gezeigt werden, dass langkettige Acyl- CoAs Bet3 im mikromolaren Bereich komplexieren, während kurzkettige Acyl-CoAs nur schwache Bindung im millimolaren Bereich zeigen. Zusätzlich wurden drei Substratbindungsstellen identifiziert. Eine ist der hydrophobe Tunnel, in welchen die Fettsäurekette einlagern muss, damit sie auf das Protein übertragen werden kann. Zwei weitere hydrophobe Bereiche wurden auf der Proteinoberfläche, nahe dem Tunneleingang, identifiziert. Möglicherweise, extrahieren diese Bindestellen Pal-CoA aus der Membran, welches dann durch eine Konformationsänderung in den Tunnel eingelagert wird.