Entwicklung eines hochsensitiven Zytotoxizitätsassays zum Nachweis von Immunantworten gegen tumorassoziierte Antigene

Abstract

Zytotoxische CD8+ T Zellen (CTL) erkennen spezifische Peptide intrazellulär prozessierter Antigene im Kontext bestimmter Haupthistokompatibilitätskomplexe der Klasse I (MHC Klasse I) bzw. humaner Leukozytenantigene der Klasse I (HLA-A,B,C) und können diese Zellen lysieren. Damit stellen CTL wesentliche Effektoren zur Eliminierung z.B. virusinfizierter Zellen oder Tumorzellen dar, deren Präsenz Aufschluss über ein aktuelles Immungeschehen oder das Immunpotential liefert. Die funktionelle Charakterisierung meist sehr geringer CTL-Frequenzen im peripheren Blut oder im Gewebe für diagnostische und wissenschaftliche Fragestellungen erfordert sensitive und flexible Methoden, die bisher nicht zur Verfügung standen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden der VITAL FR-Test (VITAL-FR) und der Plasmidtransfektionsfluorolyse-Test (PTF), zwei durchflusszytometrische Messsysteme für den experimentellen Nachweis und die Quantifizierung der CTL-Funktion, entwickelt. Die Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit beider Methoden wurde mit Hilfe immundominanter HLA A2-restringierter Epitope aus dem Phosphoprotein des humanen Zytomegalievirus (CMVpp65)495-503 und dem Matrixprotein-1 des humanen Influenzavirus (IMP 1)58-66 validiert, für Zielzellen mit definierter Expression von HLA A2 (K562-A2) sowie für autologe B-lymphoblastoide Zelllinien (B-LCL) und mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) optimiert und für den Nachweis spezifischer CTL gegen virale und tumorassoziierte Antigene getestet.

Cytotoxic CD8+ T cells (CTL) recognize specific intracellular peptides of processed antigens in the context of certain major histocompatibility complexes class I (MHC class I) or human leukocyte antigens class I (HLA-A, B, C) and can lyse these cells. Therefore CTL effectors are essential to eliminate such virus-infected cells or tumor cells and their presence provides information about a current event or the immune potential. The functional characterization of usually very low CTL frequencies in the peripheral blood or tissue for diagnostic and scientific issues requires sensitive and flexible methods that previously were not available. In this work, two flow cytometric based assay systems for the experimental detection and quantification of CTL function the VITAL-FR assay (VITAL-FR) and the Plasmidtransfektionsfluorolyse assay (PTF) were developed. The sensitivity, specificity and reproducibility of both methods was determined using immunodominant HLA-A2-restricted epitopes from the phosphoprotein of human cytomegalovirus (CMVpp65) 495-503 and the validated matrix protein-1 of the human influenza virus (IMP1) 58-66. Assay conditions were optimized for the use of different target cells with defined expression of HLA-A2 (K562 A2) as well as autologous B-lymphoblastoid cell lines (B-LCL) and mononuclear cells of peripheral blood (PBMC) and tested for the detection of specific CTL against viral and tumor associated antigens.