Protonenleitfähigkeit von TRPV1 und Multimerisierung von TRPV- Kanaluntereinheiten

Abstract

TRPV1-induzierte intrazelluläre Ansäuerung: Die Vanilloidrezeptor-verwandten "transient receptor potential" (TRPV)-Kanäle gehören zu der Superfamilie der hexahelikalen Kationenkanäle und sind integrale Komponenten der Wärme- und Schmerzwahrnehmung sowie der renalen und intestinalen Ca2+-Resorption. Der Begründer der TRPV-Subfamilie, der Vanilloid-Rezeptor (TRPV1), ein in sensorischen Neuronen exprimierter, nicht-selektiver Kationenkanal, wird sowohl durch chemische als auch durch physikalische Reize aktiviert. Hierzu gehören Vanilloide wie z.B. Capsaicin und körpereigene vanilloidähnliche Stoffe sowie Hitze. Eine Beteiligung von TRPV1 an der Regulation des intrazellulären pH war bislang noch nicht bekannt und wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Bei neutralem extrazellulärem pH, konnte eine Capsaicin-vermittelte Ansäuerung als Folge eines Ca2+-Einstroms beobachtet werden. In azidem Extrazellulärmedium hingegen konnte sowohl durch fluometrische als auch elektrophysiologische Untersuchungen eine direkte Permeation von Protonen durch die TRPV1-Pore nachgewiesen werden, was einen neuen Mechanismus darstellt. Für TRPV1 konnten sehr hohe relative Protonen- Permeabilitäten ermittelt werden, was auf einen von Metallkationen abweichenden Protonen-Permeationsmechanismus hinweist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die TRPV1-Pore permeabel für große organische Kationen wie NMDG, TEA und den fluoreszierenden Chlorid-Indikator MEQ ist. Sowohl die Ca2+-abhängige als auch die Ca2+-unabhängige intrazelluläre Azidifizierung konnte in frisch isolierten Neuronen aus Hinterwurzelganglien der Ratte nachgewiesen werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass beide Mechanismen auch im nativen Zellsystem existieren. Weiterhin konnte in elektrophysiologischen Messungen an "cell-attached"-Membranflecken TRPV1-exprimierender HEK293-Zellen eine spannungsabhängige Blockierung von TRPV1 durch Erhöhung der intrazellulären Protonenkonzentration gezeigt werden. Selektivität und Promiskuität der TRPV-Multimerisierung: In Analogie zu CNG- und spannungsabhängigen Kalium-Kanälen werden funktionelle TRPV-Kanalkomplexe durch eine Quartärstruktur aus vier Kanaluntereinheiten aufgebaut. Dies konnte bereits für TRPV1, TRPV5 und TRPV6 gezeigt werden. Da bislang keine systematischen Untersuchungen zur Ausbildung von TRPV-Homo- und Heteromultimeren vorlagen, wurde dies im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Bei der Analyse der Assemblierung von unterschiedlichen TRPV-Untereinheiten zeigte sich, dass trotz phylogenetisch enger Verwandtschaft innerhalb der TRPV- Subfamilie vorwiegend Homomultimere ausgebildet werden. Heteromultimere konnten nur für TRPV5 und TRPV6, sowie zwischen TRPV1 und TRPV2 nachgewiesen werden. Kolokalisations-Experimente mit CFP- bzw. YFP-markierten TRPV- Kanaluntereinheiten zeigten ein übereinstimmendes Verteilungsmuster der betreffenden Proteine. Eine direkte Interaktion der Kanaluntereinheiten konnte mittels FRET- und Koimmunpräzipitations-Experimenten nachgewiesen werden. Um zu klären, welche Proteindomänen an der spezifischen Interaktion zwischen TRPV-Untereinheiten beteiligt sind, wurden FRET-Experimente und Ca2+-Messungen mit N- bzw. C-terminal trunkiertem TRPV1, den cytosolischen Termini von TRPV1 und TRPV4 als auch mit chimären TRPV1/TRPV4-Kanaluntereinheiten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die cytosolischen Termini als auch die Transmembransegmente synergistisch zu der Gesamtaffinität zwischen TRPV- Kanaluntereinheiten beitragen und die Selektivität der Homo- und Heteromultimerisierung von TRPV-Untereinheiten kontrollieren.

TRPV1-induced intracellular acidification: The vanilloid receptor-related transient receptor potential channels (TRPV) belong to the superfamily of hexahelical cation channels and are integral components of thermosensation, pain perception and Ca2+-reabsorption in kidney and intestine. The vanilloid receptor (TRPV1), a poorly selective cation channel, is expressed in dorsal root ganglion (DRG) neurons and is regulated by diverse stimuli including capsaicin, endovanilloids and heat. Since a possible impact of TRPV1 activation on the intracellular pH was not known, this was investigated in this part of the study. At neutral extracellular pH, the capsaicin-induced intracellular acidification was strictly coupled to the Ca2+ influx component. In acidic extracellular media, an as yet unrecognized direct proton permeation through the nonselective TRPV1-pore could be demonstrated by fluometric and electrophysiological analyses. The high proton permeability determined for TRPV1 points to a proton entry mechanism through the TRPV1-pore which is distinct from the permeation of metal ions. Furthermore, permeation of large organic cations through the TRPV1-pore as NMDG, TEA and the fluorescent cell- impermeant chloride indicator MEQ could be demonstrated. Activation of TRPV1 both in the presence of extracellular Ca2+ and in acidic Ca2+- and Na+-free acidic KCl solutions resulted in a marked intracellular acidification in freshly isolated nociceptive dorsal root ganglion (DRG) neurons. These data indicate that both acidification mechanisms also exist in the native cellular context of nociceptive neurons. Furthermore, the intracellular acidification caused a voltage-dependent block of TRPV1 in cell-attached patches. Selectivity and promiscuity of homo- and heteromeric assembly of TRPV channel subunits: Like voltage-gated K+ channels and cyclic nucleotide-gated channels, functional channel complexes are believed to be composed of tetrameric TRPV proteins as recently shown for TRPV1, TRPV5 and TRPV6. A systematic and combinatorial analysis of TRPV homo- and heterooligomerization was lacking so far. Therefore, the aim of this part of the study was to evaluate the selectivity and promiscuity of homo- and heteromultimerization between TRPV channel subunits in living cells. To analyze the assembly of TRPV subunits in living cells, fluorescent fusion proteins or FLAG-tagged TRPV channel subunits were generated. The interaction between TRPV subunits was assessed by analysis of the subcellular colocalization, fluorescence resonance energy transfer and coimmunoprecipitation. The results point to a restricted promiscuity of heteromeric TRPV channel assembly. Besides heteromers between TRPV5 and TRPV6 or between TRPV1 and TRPV2, TRPV channel subunits preferentially assemble into homomeric complexes. To explore which protein domains contribute to the specific interaction between TRPV channel subunits, quantitative FRET analyses and Ca2+ imaging experiments with truncated TRPV1 subunits, cytosolic termini of TRPV1 or TRPV4 and chimeric TRPV channel subunits were performed. The data revealed that the specificity and the affinity of the subunit interaction may be synergistically provided by interaction modules located in the cytosolic termini and in the transmembrane domains.