Background: Epithelial ovarian cancer is one of the most frequent causes of death attributable to gynecologic malignancies, 75% of all cases being detected in advanced stages. Late detection is due to an absence of specific symptoms while the disease is still localized, as well as the lack of effective prevention, screening and early detection strategies. Despite the current improvement in surgical and medical treatment, the five-year survival rate is low. The development of new tumor marker and screening tests is one of the major current goals on this field of research. Various preclinical and early clinical studies suggest a strong involvement of immunological factors in the tumorigenesis of ovarian cancer. Cytokines are well described and supposed to play an important role in the carcinogenesis of various malignant solid tumors, including ovarian cancer. Cytokines might also contribute to tumor development by enhancing the angiogenesis and tumor cells adhesions or by interfering with the antitumoral mechanisms of the immune system, such as the down regulation of the dendritic cells. B and T lymphocytes are able to produce IL-10 under various stimuli. IL-10 synthesis by ovarian cancer cells was also reported. Only limited data are available about the clinical and prognostic value of the expression of IL-10 in serum and ascites, and of polymorphisms of IL-10 promoter gene in patients with advanced ovarian cancer. Methods: In the present study, 199 patients with histological proven ovarian cancer and a control group of 159 patients with no malignancy were included. Expression of IL-10 in serum and ascites We analyzed 114 ovarian cancer patients and 30 women without malignancy. Blood drawing and ascites collection were performed at the time of the surgical procedure. IL-10 serum and ascites concentrations were measured with an enzyme-linked immunosorbent assay kit (ELISA) according to the manufacturer’s protocol (Quantikine, R&D; Systems Inc., Minneapolis, MN, USA). All samples were measured in duplicate. The polymorphism of IL-10 promoter gene Further on we analyzed the polymorphism of IL-10 promoter gene in 147 patients with ovarian cancer and 129 patients with no malignancies. Polymorphism of IL-10 promoter gene (G/A at -1082, C/T at -819, and C/A at -592) was detected using the Pyrosequencer PSQ 96 and PSQ 96 SNP Reagents Kit (Uppsala Sweden). The oligonucleotides primers used for genotyping the -1082 (G/A) polymorphism were: forward, 5’-AACCCAACTGGCTCTCCTTA-3’ and reverse, 5’BIOTIN-GCTGGATAGGAGGTCCCTTA-3’. A C to T transition in the -819 position of the IL-10 gene was searched using the following oligonucleotides primers: forward, 5’BIOTIN-TTCTCAGTTGGCACTGGTGT-3’; reverse, 5’-AACTGTGCTTGGGGGAAGT-3’ . For analyzing the -592 position of IL-10 gene, we used the following primers: forward, 5’BIOTIN- TGGAAACATGTGCCTGAGAA-3’; reverse, 5’-CAAGCAGCCCTTCCATTTTA-3’. Surgery impact on IL-10 expression in serum in ovarian cancer patients Blood was drawn from the cubital vein of 27 patients with histologically confirmed ovarian cancer one day before surgery. Blood collection and IL-10 serum measurements were repeated 24 hours, four and eight days, after the surgery. We used ELISA technique for obtaining the IL-10 concentrations. Aim of the study: The main aim of the study was to determine the predictive and prognostic role of IL-10 in ovarian cancer patients. As secondary aims, we analyzed differences in IL-10 expression and IL-10 polymorphism pattern between oncological patients and control group, the correlation of IL-10 expression and polymorphism with classical clinical prognostic factors, the impact of polymorphism on the expression of IL-10 in serum and ascites and the impact of surgery on the circulatory levels of IL-10. Results: The median age among patients with ovarian cancer was 57 years (range 19-88 years). The distribution of FIGO tumor stage of ovarian cancer was as follows: FIGO I-II 39 (19.6%) patients and advanced disease (FIGO stage III-IV), 159 patients (80.4%). Expression of IL-10 in serum and ascites The results of the ELISA analysis showed that concentrations of IL-10 in ascites and serum were significantly increased in patients with ovarian cancer in comparison to the control group (p=0.029 and p=0.002, respectively). When analyzing the ovarian cancer patients only, the expression of IL-10 was higher in the ascites when compared with the one in serum, this remain significant even when the statistical assessment was performed separately for the primary and recurrent ovarian cancer. These results confirm the role of tumoral environment in producing several cytokines. In our study, IL-10 expression correlated with the residual tumor mass after surgery. Patients having lower IL-10 circulatory level benefit most from the cytoreductive surgery. In the multivariate analysis, expression of IL-10 in serum and the postoperative residual tumor mass were the only independent prognostic factors for overall survival. The polymorphism of IL-10 promoter gene In the second part of this study, the polymorphism of IL-10 promoter gene was analyzed. The results revealed its importance in predicting the optimal surgical outcome. The allelic distribution within IL-10 gene cluster at -819 and -592 loci showed to be significantly associated with the surgical outcome and to influence the overall survival. Our results suggest that patients with the C allele in -819 and -592 loci of IL-10 promoter gene have a better chance to achieve optimal surgical reduction. The presence of the heterozygote genotype (C/T or C/A) was associated with a decreased overall survival. The presence of C/C genotype in -819 and -592 loci was significantly associated with a better overall and disease free survival. Surgery impact on IL-10 expression in serum in ovarian cancer patients The last part of the study analyzes the impact of surgery on the circulatory levels of Il-10. The levels of IL-10 rose temporarily on day one after surgery, but then they dropped significantly on day 4 and day 8 after the surgery. The observation that IL-10 levels increase immediately after surgery and drop after that, suggests that IL-10 is produced beforehand at the site of the tumor. The kinetics of IL-10 levels show first increased circulatory levels, explained by the IL-10 mobilization from the malignant tissue depot, followed by decreased levels of IL-10. Local and systemic secretion of immunosuppressive cytokines may play an important role in the impaired anti-tumor immune function commonly observed in advanced ovarian cancer. Conclusions: In the present study we could demonstrate that the cytokine expression in serum and ascites from patients with ovarian cancer is significantly higher than in those from the control group. The increased levels of IL-10 in ascites indicate that IL-10 is primarily produced by the direct tumor environment. Serum levels correlate significantly with the postoperative residual tumor mass and the IL-10 concentration in the ascites correlate with the volume of ascites. In the multivariate analysis, lower serum levels and the absence of macroscopically residual mass were associated with better overall survival. The present data demonstrate that IL-10 promoter gene could represent a predictive factor for optimal surgical outcome. Therefore, a confirmation of these results in a prospective multicenter trial is warranted.
Hintergrund: Das Ovarialkarzinom ist eine der häufigsten Todesursachen unter den gynäkologischen Tumorerkrankungen, weil 75% aller Fälle in fortgeschrittenen Stadien entdeckt werden. Die späte Diagnose liegt nicht zuletzt am Fehlen spezifischer Symptome, während die Erkrankung noch lokal begrenzt ist, zudem auch am Fehlen von effektiven Präventions-, Screening und Früherkennungsmaßnahmen. Trotz aktueller Verbesserungen in der operativen und zytostatischen Therapie, ist die Fünfjahresüberlebensrate niedrig. Die Entwicklung neuer Tumormarker und Screeningtests ist eines der Hauptziele auf dem Gebiet der aktuellen Forschung. Verschieden präklinische und frühe klinische Studien legen eine starke Beteiligung von immunologischen Faktoren in der Tumorgenese des Ovarialkarzinoms nahe. Die Zytokine scheinen eine wichtige Rolle in der Karzinogenese verschiedener solider Tumoren inklusive des Ovarialkarzinoms zu spielen. Sie könnten auch an der Tumorentwicklung durch Förderung der Angiogenese und der Tumorzell-Adhäsion beteiligt sein oder, indem sie Einfluss nehmen auf Antitumor-Aktivitäten des Immunsystems wie durch Downregulation von dendritischen Zellen. B and T-Lymphozyten sind in der Lage, IL-10 unter verschiedenen Stimuli zu produzieren. Die IL-10-Synthese durch Ovarialkarzinom-Zellen ist ebenso schon beschrieben worden. Es gibt jedoch wenige Daten zum klinischen und prognostischen Stellenwert der Expression von IL-10 in Serum und Aszites und von Polymorphismen des IL-10-Promotergens bei Patientinnen mit einem fortgeschrittenen Ovarialkarzinom. Methodik: In die vorliegende Studie wurden 199 Patientinnen mit einem histologisch nachgewiesenen Ovarialkarzinom und eine Kontrollgruppe von 159 Patientinnen ohne eine maligne Erkrankung eingeschlossen. Expression von IL-10 in Serum und Aszites Wir untersuchten 114 Frauen mit einem Ovarialkarzinom und 30 Frauen ohne maligne Grunderkrankung. Das Blut und die Aszitesflüssigkeit wurden intraoperativ entnommen. Die Konzentrationen von IL-10 in Serum und Aszites wurden mit einem ELISA-Kit entsprechend den Herstellerangaben bestimmt (Quantikine, R&D; Systems Inc., Minneapolis, MN, USA). Es erfolgten jeweils Doppelbestimmungen. Der Polymorphismus des IL-10-Promotorgens Weiterhin untersuchten wir den Polymorphismus des IL-10-Promotorgens bei147 Patientinnen mit Ovarialkarzinom und 129 Patientinnen ohne eine maligne Grunderkrankung. Der Polymorphismus des IL-10-Promotorgens (G/A bei -1082, C/T bei -819, und C/A bei -592) wurde detektiert mittels des Pyrosequencer PSQ 96 und PSQ 96 SNP Reagentien-Kit (Uppsala Sweden). Die Oligonucleotid-Primer zur Genotypisierung des -1082 (G/A) Polymorphismus waren: vorwärts, 5’-AACCCAACTGGCTCTCCTTA-3’ und rückwärts, 5’BIOTIN-GCTGGATAGGAGGTCCCTTA-3’. Die A C to T-Transition in der -819 Position des IL-10-Gens wurde gesucht mittels der folgenden Oligonucleotid-Primer: vorwärts, 5’BIOTIN-TTCTCAGTTGGCACTGGTGT-3’; rückwärts, 5’-AACTGTGCTTGGGGGAAGT-3’. Zur Untersuchung der -592 Position des IL-10-Gens wurden die folgenden Primer verwendet: vorwärts, 5’BIOTIN- TGGAAACATGTGCCTGAGAA-3’; rückwärts, 5’-CAAGCAGCCCTTCCATTTTA-3’. Der Einfluss der Operation auf die IL-10-Expression im Serum bei Ovarialkarzinom- Patientinnen Hierzu wurde venöses Blut aus der Cubitalvene bei 27 Patientinnen mit einem histologisch gesicherten Ovarialkarzinom einen Tag vor geplanter Operation entnommen. Diese Blutentnahme zur Bestimmung des IL-10 im Serum wurde 24 Stunden, vier und acht Tage nach der Operation wiederholt. Zur Bestimmung des IL-10 wurde ein ELISA-Kit verwendet (Quantikine, R&D; Systems Inc., Minneapolis, MN, USA). Ziel der Studie: Hauptziel der Studie war es, die prädiktive und prognostische Rolle des IL-10 bei Ovarialkarzinom- Patientinnen zu untersuchen. Sekundäre Ziele waren die Analyse der Unterschiede in der IL-10-Expression im Muster des IL-10-Polymorphismus zwischen den Krebspatientinnen und der Kontrollgruppe und der Korrelation der IL-10-Expression und des Polymorphismus mit klassischen klinischen Prognosefaktoren sowie des Einflusses des Polymorphismus auf die Expression des IL-10 in Serum und Aszites und des Einflusses der Operation auf zirkulierende Spiegel des IL-10. Ergebnisse: Das mediane Alter der Patientinnen mit Ovarialkarzinom war 57 Jahre (Spannweite 19-88 Jahre). Die Verteilung der FIGO-Tumorstadien war wie folgt: FIGO I-II 39 (19,6%) Patientinnen und fortgeschrittene Tumorstadien (FIGO III-IV) 159 Patientinnen (80,4%). Expression von IL-10 in Serum und Aszites Die Konzentrationen von IL-10 in Aszites und Serum waren signifikant erhöht bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom gegenüber der Kontrollgruppe (p=0.029 bzw. p=0.002). Wurden nur die Ovarialkarzinom-Patientinnen betrachtet, war die Expression des IL-10 höher im Aszites im Vergleich zum Serum, dieser Unterschied blieb auch signifikant, wenn die Patientinnen mit primärem und rezidiviertem Ovarialkarzinom separate analysiert wurden. Diese Ergebnisse bestätigen die Rolle der Tumorumgebung bei der Produktion mehrerer Zytokine. In unserer Studie korrelierte die IL-10 Expression mit dem postoperativen Tumorrest. Patientinnen mit niedrigen Serum-IL-10-Spiegeln profitierten demnach am meisten von einer radikalen operativen Tumorreduktion. Nach der Multivarianzanalyse waren die Expression des IL-10 im Serum und der postoperative Tumorrest die einzigen unabhängigen Prognosefaktoren für das Gesamtüberleben von Patientinnen mit primäre Ovarialkarzinom. Der Polymorphismus des IL-10-Promotorgens Im zweiten Teil dieser Studie, wurde der Polymorphismus des IL-10-Promotorgens untersucht. Die Ergebnisse unterstreichen seine Bedeutung in der Vorhersage des optimalen operativen Outcomes. Die Allel-Verteilung innerhalb des IL-10-Genclusters, an den Stellen -819 und -592 war signifikant assoziiert mit dem operativen Outcome und zeigte einen Einfluss auf das Gesamtüberleben. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Patientinnen mit einem C-Allel an den Genorten -819 und -592 des IL-10 Promotorgens eine höhere Wahrscheinlichkeit auf eine optimale operative Tumorreduktion haben. Das Vorliegen eines heterozygoten Genotyps (C/T oder C/A) war assoziiert mit einem verschlechterten Gesamtüberleben. Das Vorliegen eines C/C Genotyps an den Genorten -819 und -592 war signifikant assoziiert mit einem verbesserten Gesamt- und krankheitsfreien Überleben. Der Einfluss der Operation auf die IL-10-Expression im Serum bei Ovarialkarzinom- Patientinnen Im letzten Teil der Studie untersuchten wir den Einfluss der operative Therapie auf die zirkulierenden Spiegel des IL-10. Die Spiegel des IL-10 stiegen vorübergehend am ersten postoperativen Tag, um dann signifikant abzufallen am Tag 4 und 8. Diese Beobachtung des Anstiegs der IL-10-Spiegel unmittelbar nach der Operation und des Abfalls danach sprechen dafür, dass das IL-10 am Ort des Tumors früh produziert wird. Die Kinetik der IL-10-Spiegel zeigte zunächst erhöhte zirkulierende Spiegel als Ausdruck der Mobilisierung von IL-10 aus dem malignen Gewebe, gefolgt von abfallendem IL-10. Die lokale und systemische Sekretion von immunouppressiven Zytokinen könnte eine wichtige Rolle bei der Schwächung des Immunsystems mit Bezug auf seine antitumoröse Funktion spielen, wie sie häufig beim fortgeschrittenen Ovarialkarzinom beobachtet wird. Schlussfolgerung: In der vorliegenden Studie konnten wir zeigen, dass die Zytokin-Expression in Serum und Aszites bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom signifikant höher war als in der Kontrollgruppe. Die erhöhten Spiegel des IL-10 im Aszites zeigen an dass das IL-10 primär durch die direkte Tumorumgebung produziert wird. Die Serumspiegel korrelierten signifikant mit dem postoperativen Tumorrest und die IL-10-Konzentrationen im Aszites korrelierten mit dem Volumen des Aszites. In der Multivarianzanalyse waren niedrigere Serumspiegel und das Fehlen eines makroskopischen Tumorrestes assoziiert mit einem verbesserten Gesamtüberleben. Die aktuellen Daten zeigen, dass das IL-10-Promotorgen einen prädiktiven Faktor für ein optimales operatives Outcome darstellen könnte. Daher sollte eine Bestätigung dieser Ergebnisse in einer prospektiven Multicenter-Studie erfolgen.
