Signaltransduktion und Signalverarbeitung des probiotischen Bakteriums E. coli Nissle 1917 in vitro

Abstract

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet. Der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. Ziel: Die genauere Charakterisierung der Rolle von Toll-like Rezeptoren und kostimulatorischen Moleküle bei der Entstehung einer T-Zell vermittelten Immunantwort auf EcN. Methoden: Periphere und Lamina propia T-Zellen von Wildtyp, TLR-2 und TLR-4 Knock-Out Mäusen wurden stimuliert und anschließend mit und ohne EcN Überstand kultiviert. Durchflußzytometrisch wurden der DNA-Gehalt sowie die TZell Rezeptor und Toll-like Rezeptor Expressivität bestimmt. Untersuchungen der Zelladhäsion an Bestandteilen der extrazellulären Matrix (Fibronektin und Kollagen) wurden durch luminometrische Bestimmungen der mit Fluoreszin markierten Zellen durchgeführt. TLRnegative HEK293 Zellen wurden mit hTLR-2 und hTLR-4 transfiziert und stimuliert, um anschließend die NFκB-Aktivität und daraus resultierend die Signaltransduktion via TLR Rezeptor mit einem Chemiluminescenz Assay zu bestimmen. Die Bestimmung erfolgte mit und ohne Zugabe von EcN Überstand. Ergebnisse: Konditioniertes Medium von EcN hemmt signifikant die TLR-2 und TLR-4 Expression in PBT von Wildtyp Mäusen, jedoch nicht in TLR- 2 und TLR-4 Knock-Out Tieren. Sowohl bei TLR-2, als auch bei TLR-4 transfizierten HEK293 Zellen ist nach Inkubation mit EcN eine deutliche konzentrationsabhängige Erhöhung der Aktivität zu erkennen. Die Adhäsion von Wildtyp und TLR-2 peripheren und Lamina propria TZellen an Kollagen und Fibronektin sinkt nach Zugabe von zellfreiem Überstand von EcN. Im Gegensatz dazu wird die Adhäsion von TLR-2 T-Zellen nicht gehemmt. Diskussion: Es konnte gezeigt werden, dass zellfreier Überstand von EcN distinktiv die T-Zell Funktion moduliert. EcN beeinflusst signifikant die TLR-2 und TLR-4 Expression. Da die Hemmung des Zellzyklus von T-Zellen bei TLR-2 und -4 Mäusen nicht nachgewiesen werden konnte, scheint eine Funktion derselben bei der Wirkungsentfaltung von EcN auf T-Zellen wahrscheinlich. Während das gemeinsame Vorhandensein von TLR-2 und -4 zur T-Zell Aktivierung nötig ist, scheint die Hemmung der T-Zell Adhäsion nur TLR-4 abhängig. Dies macht verschiedene Wege der Signaltransduktion zur Wirkungsentfaltung von EcN wahrscheinlich.

Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious to maintain remission of ulcerative colitis and pouchitis, the underlying mechanisms of action still remain elusive. A major role in the initiation and perpetuation of chronic IBD is attributed to the luminal bacterial flora. Several studies have demonstrated that bacterial products can activate T cells via Toll-like receptors even in the absence of antigen-presenting cells or costimulatory molecules, suggesting a direct link between the luminal bacterial flora and the immune system. Aims: To explore the role of TLR`s and costimulatory molecules in the response of T cells towards EcN. Methods: Peripheral blood (PBMC) and lamina propria (LPMC) mononuclear cells from wildtype, TLR-2 and TLR-4 knockout mice were stimulated and cultered in the presence or absence of sterile filtered EcN supernatants (EcN-SC). Flow cytometry analysis was used to assess DNA content (PI), T-cell receptor and TLR expression. Cell adhesion to the ECM components fibronectin and collagen was measured by using an adhesion assay based on luminometric analysis of fluorescently labelled cells. TLR-negative HEK293 cells were stably transfected with hTLR-2 and hTLR-4 and stimulated in the presence and absence of EcN supernatants followed by measurement of NF-κB activity using a chemiluminescence assay. Results: EcN-SN significantly increases TLR-2 and TLR-4 expression in wildtype PBMC. EcN-SN significantly inhibits cell cycle progression of activated wildtype PBMC, but not PBMC from TLR-2 or -4 deficient mice. Further EcN-SN increases NF-κB activity in TLR-2 and TLR-4 transfected HEK293 cells and inhibits adhesion of Wildtype and TLR-2 PBMC and LPMC to collagen and fibronectin. In contrast, the inhibition of T-cell adhesion to fibronectin is reduced in TLR-2 T-cells. Discussion: We firstly demonstrated that cell free supernatants of EcN distinctively modulates T cell function. EcN increases TLR-2 and -4 expression and activate NF-κB via these receptors. Consequently, inhibition of T cell cycling by EcN is not observed in TLR-2 or -4 knockout mice, demonstrating that these receptors are crucial in mediating the effects of EcN to T cells. Whereas the effects of EcN on T cell activation are TLR-2 and -4 dependent, the inhibition t cell adhesion to the ECM to be only TLR-4 dependent, indicating that EcN use distinct signaling pathways to exert its broad biological functions.