Interactions of zinc with the intestinal epithelium - effects on transport properties and zinc homeostasis

Abstract

In modern piglet nutrition, diets are often supplemented with high doses of zinc oxide to decrease the incidence of weaning-associated diseases such as post-weaning diarrhea. However, the underlying mechanisms by which high zinc concentrations exert their effects within the organism are not sufficiently elucidated and concerns exist regarding the environmental pollution by zinc- loaded liquid manure. The present thesis investigated the effect of zinc on transport properties in the small intestine of piglets initially in a feeding trial. Zinc effects seemed to depend on its acute application at the intestinal epithelium and furthermore on the side of application in vitro. In association with previous observations of Lodemann et al. (2013) showing a distinct influence of high zinc levels on viability and barrier properties of intestinal epithelial cells, the present thesis further aimed at elucidating the homeostatic mechanisms that may prevent toxic effects of high zinc concentrations in the intestine of piglets. The first study involved a feeding trial with piglets being fed marginal (50 ppm), normal (150 ppm), or pharmacological concentrations (2500 ppm) of zinc oxide and an investigation of its impact on jejunal transport properties. Ussing chamber experiments with jejunal isolated epithelia were performed with several substances stimulating either absorptive (L-glutamine, Dglucose) or secretory (prostaglandin E2, carbachol, E. coli heat-stable enterotoxin) transport. In addition to chronic dietary zinc supplementation, the effect of acute zinc application was tested in vitro. The dietary zinc supplementation had no significant influence on absorptive and secretory responses. However, with an exception for carbachol, the acute zinc treatment in vitro led to small but significant decreases in both absorptive and secretory capacities. In conclusion, chronic zinc supplementation in the post-weaning phase sustainably affected neither the absorptive nor the secretory transport properties within the jejunum. However, as the jejunal transport was influenced by acute zinc addition in vitro, it is proposed that the potential epithelial effects of zinc depend on the acute presence of this ion at the intestinal epithelium. In the second part of this thesis, cell culture experiments with the porcine cell line IPEC-J2 and the human cancer cell line Caco-2 were performed. On the assumption that the tight regulation of intracellular zinc homeostasis in enterocytes of weaned piglets is a crucial necessity, the aim of this study was to elucidate the way that porcine intestinal epithelial cells regulate intracellular zinc homeostasis and maintain it during a challenge with increasing extracellular zinc concentrations. A further question was whether the differentiation status of the cells (preconfluent/ postconfluent) or the duration of zinc exposure (6 or 24 h) affected the response to increasing zinc concentrations. The intracellular zinc content rose dose-dependently in both cell lines with increasing extracellular zinc concentrations. Correspondingly, the expression of the zinc efflux transporter 1 (ZnT1) and of metallothionein (MT1A) were upregulated, whereas the zinc influx transporter 4 (ZIP4) was downregulated. The mRNA expression of the metal response element-binding transcription factor 1 (MTF-1) remained largely unchanged. However, a higher MTF-1 abundance was detected in IPEC-J2 cells after incubation with the highest zinc concentration (200 μM). The effects of increasing zinc concentrations were partly different between cell lines and maturation status. The time of exposure to zinc also evoked an impact. In conclusion, the second study showed that an adaptation of the tested target genes was responsible for regulating zinc homeostasis in response to increasing zinc concentrations. However, despite the induction of compensatory mechanisms, an increase in intracellular zinc levels was observed after high extracellular zinc levels had been applied, indicating that high zinc levels and a longer incubation time might exceed the capacity of homeostatic regulation. Toxic effects, as previously assessed by Lodemann et al. (2013), can occur because of an imbalance of zinc homeostasis. Therefore, long-term supplementation with high levels of dietary zinc cannot be recommended, as it may induce homeostatic imbalances with negative effects on the animal.

In der modernen Ernährung von Ferkeln wird das Futter der Tiere häufig mit hohen Dosen an Zinkoxid supplementiert, um das Auftreten mit dem Absetzen assoziierter Erkrankungen, wie zum Beispiel Durchfallerkrankungen, zu vermindern. Allerdings sind die zugrundeliegenden Mechanismen, über welche die hohen Zinkkonzentrationen ihre Effekte innerhalb des Organismus entfalten, unzureichend erforscht und es existieren Bedenken bezüglich der Umweltbelastung durch zinkhaltige Gülle. Die vorliegende Arbeit untersuchte zunächst in einem Fütterungsversuch den Effekt von Zink auf Transporteigenschaften im Dünndarm von Ferkeln. Zinkeffekte zeigten sich in vitro in Abhängigkeit von seiner akuten Applikation am intestinalen Epithel und von der Applikationsseite. In Verbindung mit vorherigen Untersuchungen von Lodemann et al. (2013), welche einen deutlichen Einfluss hoher Zinkkonzentrationen auf die Vitalität und Barriereeigenschaften von intestinalen, epithelialen Zellen zeigten, verfolgte die vorliegende Arbeit weiterhin das Ziel, die homeostatischen Mechanismen aufzuklären, welche toxische Effekte hoher Zinkkonzentrationen im Verdauungstrakt von Ferkeln vermeiden könnten. In der ersten Studie wurde ein Fütterungsversuch durchgeführt, in dem Ferkel nach dem Absetzen niedrige (50 ppm), normale (150 ppm) oder pharmakologische Konzentrationen (2500 ppm) an Zinkoxid mit dem Futter erhielten und in dem nachfolgend die Effekte der Fütterung auf die jejunalen Transporteigenschaften untersucht wurden. Hierfür wurden Ussing- Kammer Versuche mit isolierten jejunalen Epithelien durchgeführt, wobei durch verschiedene Substanzen der sekretorische (Prostaglandin E2, Carbachol, E. coli Enterotoxin) und absorptive (L-Glutamin, D-Glukose) Transport am Epithel stimuliert wurde. In Ergänzung zur chronischen Zinkfütterung wurde auch der Effekt einer akuten Zinkzugabe in vitro untersucht. Die diätetische Zinksupplementierung hatte weder auf den absorptiven noch auf den sekretorischen Transport einen signifikanten Effekt. Allerdings führte die akute Zinkapplikation in vitro zu einer schwachen aber signifikanten Senkung der absorptiven und auch sekretorischen Kapazität. Folgende Schlussfolgerungen lassen sich deshalb ziehen: Die chronische Zinksupplementierung in der Phase nach dem Absetzen hat weder die absorptiven noch die sekretorischen Transporteigenschaften des Jejunums nachhaltig beeinflusst. Da der jejunale Transport allerdings durch die akute Zinkapplikation in vitro verändert wurde, nehmen wir an, dass potentielle, epitheliale Zinkeffekte von der akuten Präsenz dieses Ions am intestinalen Epithel abhängen. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurden Zellkulturversuche mit der intestinalen, epithelialen porcinen Zelllinie IPEC-J2 und der humanen Tumorzelllinie Caco-2 durchgeführt. Basierend auf der Annahme, dass die strenge Regulation der intrazellulären Zinkhomöostase in Enterozyten von Absatzferkeln von entscheidender Bedeutung ist, war das Ziel dieser Studie, die Mechanismen aufzuklären, welcher sich porcine intestinale Zellen bedienen, um die intrazelluläre Zinkhomöostase zu regulieren und während der Einwirkung hoher, extrazellulärer Zinkkonzentrationen aufrecht zu erhalten. Eine weitere Frage war, ob der Differenzierungsgrad der Zellen (prekonfluent/ postkonfluent) und die Einwirkdauer (6 h vs. 24 h) die Reaktion auf steigende Zinkkonzentrationen beeinflusst. Der intrazelluläre Zinkgehalt stieg mit ansteigenden extrazellulären Zinkkonzentrationen dosisabhängig bei beiden Zelllinien. Damit verbunden war auch eine Heraufregulation des Efflux-Zinktransporters 1 (ZnT1) und von Metallothionein (MT1A), während der Influx-Zinktransporter 4 (ZIP4) herunterreguliert war. Die Expression des Metallresponsiven Transkriptionsfaktors (MTF-1) zeigte sich weitgehend unverändert. Allerdings konnte eine höhere Abundanz von MTF-1 in IPEC-J2 Zellen nach Inkubation mit der höchsten Zinkkonzentration (200 μM) festgestellt werden. Zusätzlich zu den konzentrationsabhängigen Effekten konnten auch Unterschiede in Abhängigkeit der Zelllinie und des Differenzierungsgrades der Zellen festgestellt werden. Desweiteren spielte auch die Inkubationszeit eine Rolle. Schlussfolgernd zeigte die zweite Studie eine Anpassung der untersuchten, für die Regulation der Zinkhomöostase verantwortlichen Zielgene als Reaktion auf die Inkubation mit ansteigenden Zinkkonzentrationen. Allerdings wurde trotz der Induktion kompensatorischer Mechanismen ein Anstieg des intrazellulären Zinkgehaltes in beiden Zelllinien nach der Inkubation mit hohen Zinkkonzentrationen beobachtet, was darauf hindeuten könnte, dass diese hohen Konzentrationen und lange Inkubationszeiten die Kapazität der homöostatischen Regulation übersteigt. Toxische Effekte, wie sie zuvor von Lodemann et al. (2013) gezeigt wurden, können aufgrund eines Ungleichgewichtes der Zinkhomöostase entstehen. Eine Langzeitsupplementierung des Futters von Ferkeln mit hohen Zinkdosen ist daher nicht zu empfehlen, da dies ein Ungleichgewicht innerhalb der Zinkhomöostase mit darauf resultierenden negativen Effekten auf das Tier verursachen kann.