Die frühe Expression der Isoformen des Natrium-Protonen-Austauschers im experimentellen Myokardinfarkt der Ratte

Abstract

Der Natrium-Protonen-Austauscher ist neben dem Protein Histidin, dem Cl-/HCO3-Austauscher und Na+-HCO3- Cotransporter an der pH-Regulation der Zelle beteiligt. Man hat jedoch beobachtet, dass der Natrium-Protonen- Austauscher im physiologischen pH-Bereich eher unbedeutend ist. Mit fallendem intrazellulärem pH-Wert wird der Antiporter schnell aktiviert und erreicht seine maximale Transportrate bei einem intrazellulären ph-Wert von 1, indem er ein extrazelluläres Na+ gegen ein intrazelluläres H+ durch die Plasmamembran austauscht. Die Folge ist eine intrazelluläre Akkumulation von Natrium. Die Ausstoßung von Natrium durch die Na/K-ATPase nimmt mit fallendem Energiegehalt der Zelle ab. Der erhöhte intrazelluläre Gehalt an Na+ kann zu einer Aktivierung des Na+/Ca2+-Austauschers führen, der ein intrazelluläres Na+ gegen ein extrazelluläres Ca2+ austauscht. Die Folge ist eine intrazelluläre Akkumulation von Calcium. Zellnekrose, Kontraktionen und Arrhythmien können die Folge sein. Der experimentell induzierter Myokardinfarkt der Ratte erfolgt durch die permanente Ligation des Ramus interventrikularis anterior. Bei den Kontrolltieren erfolgt die Scheinoperation, bei der man den Knoten neben der A. coronaria sinistra in den Herzmuskel setzt. Die Tiere werden jeweils nach 30 min., 3 h, 6 h, 24 h, 72 h und 7 d getötet. Aus dem Myokard gewonnene RNA wird mittels Reverser Transkriptase in die cDNA umgeschrieben. Anschließend wird eine qualitative rt-PCR vor dem Hintergrund durchgeführt, ob verschiedene Isoformen des Natrium-Protonen-Austauschers (NHE 1-4) im Myokardgewebe nachzuweisen sind. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung kann die Expression der mRNA des Natrium-Protonen-Austauschers direkt auf dem zu untersuchenden Gewebe dargestellt werden. Die radioaktiv markierten Sonden binden an die im Gewebeschnitt gesuchte mRNA. Die RNA-Sonden fungieren als Antisense- Positivkontrolle bzw. Sense-Negativkontrolle. Die so gegebenenfalls radioaktiv markierten RNA-Hybride werden durch Zählung der Silberkörner pro Zellkern quantifiziert. Die Ergebnisse der beiden Gruppen (Myokardinfarkt und Kontrollgruppe) werden miteinander verglichen. Die rt-PCR ergibt, dass rNHE-1, rNHE-3 und rNHE-4 sowohl im Infarktmyokard als auch im Kontrollmyokard exprimiert werden. Außerdem ergibt die rt-PCR, dass rNHE-2 weder im Infarkt-, noch im Kontrollmyokard bei gleichzeitig deutlich positivem Signal in der positiven Kontrolle (Dünndarm) exprimiert wird. Somit lässt sich feststellen, dass die Isoform rNHE-2 im Rattenmyokard nicht exprimiert wird. Die Ergebnisse der in situ Hybridisierung sind zum Teil signifikant. Einen signifikanten Unterschied zwischen dem Infarktmyokard und dem Kontrollmyokard gibt es bei der rNHE-4-Isoform. Bei den Isoformen rNHE-1 und rNHE-3 ergeben sich Unterschiede im Expressionsnieveau zwischen dem Infarktmyokard und dem Kontrollmyokard. Das Expressionsniveau im Infarktmyokard ist in nahezu allen Fällen höher, als im Kontrollmyokard, das Ergebnis ist jedoch nur zum Teil signifikant.

Sodium-hydrogen exchanger is one of the major intracellular pH regulatory mechanism, particulary during pathologic conditions such as myocardial ischemia. It regulates intracellular pH by extruding one H+ in exchange for one Na+ and can result in accumulation of intracellular Na+. The increased levels of intracellular Na+ have been suggested to be able to alter the reversal potential of Na+/Ca2+ exchanger and Ca2+ entry may occur by this bidirectional exchanger. Excess calcium may therefore accumulate and is believed to cause detrimental effects including cell necrosis, contracture and arrhythmias. Four isotypes of sodium-hydrogen exchanger are identified. We investigate the expression of mRNA in a rat model of ischeamic myocardium and control myocardium with PCR and in situ hybridization. After ligation of ramus interventricularis anterior rat lived 30min, 3h, 6h, 24h, 72h and 7d. Sham group rat lived also 30min, 3h, 6h, 24h, 72h and 7d. The major, but not sole, isoform present in cardiac cells is NHE-1, also refered to as the ubiquitous or "housekeeping" form. We found with PCR that in cardiac cells are expressed also NHE-3 and NHE-4. We couldn´t find the isoform NHE-2 in cardiac cells neither in ischeamic myocardium nor in control myocardium. In situ hybridization of tissue section showed significant increased of NHE-4 in ischeamic myocardium compared with sham group. The expression of NHE-1 and NHE-3 are also increased in ischeamic myocardium but not significantly all groups.