Selektion endothelzellspezifischer Antikörper mittels Phage Display: Selection of endothelial cell specific antibodies by phage display

Abstract

Die Entwicklung von Antikörpern gegen zellspezifische Oberflächenmarker ermöglichen die selektive Anwendung von therapeutisch wirksamen Effektoren, die an Antikörper gekoppelt an ihren Wirkort transportiert werden können. Entscheidend für den therapeutischen Effekt ist neben derWahl des Effektors die Art und Spezifität der Zielstruktur. Solche neuen und spezifischen Zielmoleküle sind daher von hohem medizinischem Wert. Phage Display ist eine effektive und etablierte Methode zur Selektion von Antikörpern aus scFv- Phagenbibliotheken gegen Proteine. Die Suche nach Antikörpern gegen unbekannte Antigene wie zell- oder gewebespezifischen Markern erfordert alternative Selektionsstrategien auf komplexen Antigenquellen. Für die Entwicklung anti- angiogener Therapieansätze müssen z. B. entsprechende Zielstrukturen auf Endothelzellen gefunden werden.

In dieser Arbeit wurde eine Phage Display Methode zur Isolierung von hochspezifischen Antikörpern gegen unbekannte Antigene auf primären Endothelzellen etabliert. Mit dieser Oberflächenselektion konnten scFv-Phagen isoliert werden, die hochspezifisch für Endothelzellen sind. Die Zellspezifität dieser Phagenantikörper konnte in ELISA-Experimenten bestimmt und durch immunhistochemische Färbungen von Blutgefäßen auf verschiedenen Gewebeschnitten aus gesundem und Tumorgewebe bestätigten werden. Die Anwendung von Antikörpern in Immuntoxinen oder gentherapeutischen Ansätzen ist von einem zielgerichteten Transport in die Zelle abhängig. Bis heute sind erfolgreiche Antikörper Phage Display Strategien für die Selektion internalisierender scFv- Phagen hauptsächlich auf Zellen mit einem überexprimierten Rezeptor wie dem EGF-Rezeptor auf Tumorzell-Linien oder transfizierten Zellen beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Selektionsstrategien erweitert, und die Isolierung von internalisierenden scFv-Phagen auf primäre Endothelzellen übertragen. Dabei zeigte ein Vergleich von zwei verschiedenen Internalisierungsselektionen, dass eine multivalente Präsentation der Antikörperfragmente notwendig ist, um internalisierende scFv-Phagen zu isolieren. Mit einer modi- fizierten scFv-Phagenbibliothek, die eine multivalente Präsentation der scFv-Fragmente auf der Phagenoberfläche erlaubte, konnten drei verschiedene scFv-Phagen isoliert werden, für die eine Internalisierung mit immunfluoreszenzmikroskopischen Experimenten nachgewiesen wurde. Die in dieser Dissertation etablierten Protokolle können als Basis dienen, um Zellselektionen auf oberflächenspezifische oder internalisierende Antigene in Zukunft kontrollierter durchzuführen und weiter auszuarbeiten. Außerdem kann die erarbeitete Methodik bestehende Verfahren zur Antigenidentifizierung mittels Phage Display Selektionen ergänzen. Die auf diesem Wege zugänglichen Antigenstrukturen kommen möglicherweise als neue therapeutische ode diagnostische Marker in Frage.

The development of antibodies against cell specific surface markers allows the selective application of therapeutic effectors that can be used for antibody targeted delivery after antibody coupling. Apart from the choice of the effector, the therapeutic effect depends on the specificity of the target structure. Therefore, new and specific target molecules are of outstanding medical interest. Phage display is an effective and established method for the selection of antibodies from scFv phage libraries against proteins. The search for antibodies against unknown antigens such as cell or tissue specific markers requires selection strategies on complex antigen sources. For the development of anti-angiogenic approaches e.g. appropriate target structures on endothelial cells must be found.

In this thesis a phage display method for the isolation of highly specific antibodies on primary endothelial cells was established. Using this surface selection, scFv phages with high endothel cell specificity could be isolated. Cell specificity of these phage antibodies was confirmed by ELISA experiments and immunohistochemical staining of blood vessels on slides from healthy and tumor tissue. The application of antibodies in immunotoxins or in gene therapy depends on a targeted transport into the cell. Until today, successful antibody phage display strategies for the selection of internalizing scFv- phages have mostly been described on cell lines which overexpress a receptor molecule such as the EGF receptor on transfected cells or certain tumor cell lines. An extension of the described surface selection on primary endothelial cells allowed the isolation of internalizing scFv-phage. The comparison of two different internalizing selection strategies on endothelial cells showed that a multivalent presentation of antibody fragments is necessary to isolate internalizing scFv-phage. With a modified scFv-phage library that allowed a multivalent presentation of scFv-fragments on the phage surface, three different scFv phages were isolated. Internalization of these three phage antibodies could be shown by means of immunofluorescence microscopy experiments. The established protocols of this work can be used as starting point to perform and improve cell selections against surface specific or internalizing antigens under more controlled conditions in the future. Furthermore, this methodology will supplement existing antigen identification techniques. The accessible antigen structures could possibly be used as new therapeutic or diagnostic markers.