Selektive chemische Modifikation von Siliziumnitrid-Oberflächen für neuartige biosensorische Applikationen

Abstract

Biosensoren gewinnen in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung. So erfolgt die Identifizierung des Analyten mit Biosensoren deutlich schneller und unkomplizierter als mit herkömmlichen analytischen Methoden. Aufgrund des Schlüssel-Schloss-Prinzips ist zudem die Detektion von Biosensoren äußerst selektiv. Die Herstellung dieser Sensoren erfolgt häufig trotz der Unzuverlässigkeit der Silanchemie über die Silanisierung der Si-H- bzw. Si-OH- Bindungen an der Silizium-Oberfläche. Die Abhängigkeit von Temperatur- und pH- Wert, sowie die Veränderung der Filmdicke bei nur kleinen Schwankungen des Wassergehalts während der Umsetzung werden oft vernachlässigt. Seltener wird die Si-NHx-Bindung genutzt, um dünne organische Filme zu erzeugen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Funktionalisierungsstrategie entwickelt, die die Silanchemie vermeidet. Die Idee basiert auf der Herstellung einer Azid- terminierten Oberfläche erzeugt aus Oberflächenaminen des materialintrinsischen Stickstoffs von Siliziumnitrid (Si3N4). Diese Azidgruppen bildeten die Grundlage für die Click-Chemie mit geeigneten Alkin- terminierten (Bio)molekülen und die anschließende Immobilisierung von ausgewählten Analyten. Die Funktionalisierungsstrategie umfasst die Erzeugung von NHx-terminierten Si3N4-Oberflächen durch Flusssäureätzung gefolgt von deren Umwandlung in Azidgruppen durch verschiedene Methoden. Im Anschluss wurden Alkine durch die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC, Click-Chemie) an die Azid-terminierte Oberfläche immobilisiert. Der Erfolg der einzelnen Reaktionsschritte wurde durch oberflächenanalytische Methoden, durch XPS, NEXAFS und ToF-SIMS, überprüft. Die Charakterisierung der gebildeten Triazolringe erfolgte anhand des N 1s-XP-Spektrums sowie der NEXAFS C K-Kante. Die CF3-Gruppe wurde anhand der C 1s und F 1s-XP-Spektren, sowie der NEXAFS F K-Kante identifiziert. ToF-SIMS Untersuchungen bestätigten ebenfalls die Bindung des Alkins an die Si3N4-Oberfläche. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die direkte Anbindung eines Biomoleküls an die Si3N4 Oberfläche getestet. Hierfür wurde das Biotin/Streptavidin-System durch eine Click- Reaktion an der Oberfläche verankert. Die erfolgreiche Biotin/Streptavidin- Interaktion wurde ebenfalls mit XPS, NEXAFS und ToF-SIMS nachgewiesen. Der Erfolg der Click-Reaktionen war sowohl bei der Methodenentwicklung als auch bei der Immobilisierung des Modellfilms vom genutzten Lösungsmittel abhängig. Neben der direkten Immobilisierung von (Bio)molekülen an die Si3N4-Oberfläche durch die Click-Chemie gelang es auch einen Kupfer(II )trifluormethoxyphenanthrolin-Komplex als künstliche Nuklease über Amid- Kopplung an die Si-NHx-Oberfläche zu binden. Hierbei diente ein OCF3-Substituent des Kupfer(II)trifluormethoxyphenanthrolin-Komplexes als XPS- Sonde. Die Identifizierung des Komplexes erfolgte anhand der OCF3-Komponente im C 1s- und F 1s-XP-Spektrum und der NEXAFS F K-Kante, sowie des Cu 2p-XP- Spektrums. Die ToF-SIMS-Massenspektren bestätigten ebenfalls die Bindung des Komplexes. Die Kupfermenge wurde mit der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) zu 0.08 µg/cm2 bestimmt, was 87 x 1012 Kupferatome pro cm2 entspricht. Nach der Verifizierung des immobilisierten Komplexes erfolgte die Untersuchung der Spaltaktivität der auf der Si3N4-Oberfläche gebundenen künstlichen Nuklease gegenüber Plasmid-DNA. Hierbei wurde eine Zunahme der Spaltaktivität mit zunehmender DNA-Inkubationszeit festgestellt. Weiterhin ist bemerkenswert, dass der verwendete Kupfer(II )trifluormethoxyphenanthrolin-Komplex erst auf der Oberfläche seine Spaltaktivität entfaltet. Kontrollproben in Lösung zeigten im Gegensatz zu dem immobilisierten Komplex keine Spaltaktivität.

In recent years, biosensors have become more and more important. The identification of the analyte is much faster and easier by using biosensors instead of classical analytical methods. Biosensors are enormously selective due to the key-lock principle. For example, biosensors found applications in medical diagnostics. The used sensors are often produced via silanization of Si-H or Si-OH bonds at surfaces of silicon wafers. However, the known problems of the silane chemistry, as its dependency on temperature, water content of the solution and pH, as well as the hardly controllable film thickness, often lead to low performance in real applications. However, so far Si-NHx bonds have been used rarely to produce thin organic layers for biosensing applications. This work presents the development of a novel functionalization strategy for silicon nitride (Si3N4) surfaces bypassing the problems of the unreliable silane chemistry. The aim was to prepare azide-terminated surfaces as foundation for the modification by forming Si-NHx bonds in the surface layer of Si3N4 films. These azide groups served as a basis for click chemistry with suitable alkyne-terminated (bio)molecules for subsequent immobilization of selected analytes. Our functionalization route comprises the generation of NHx-terminated Si3N4 surfaces by fluoride etching followed by the conversion into azide groups by various methods. Fluorine-substituted alkyne-terminated molecules were immobilized at the azide-terminated surface via copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC, click chemistry). The success of the reaction has been proven by surface chemical analysis using XPS, NEXAFS and TOF-SIMS. Triazole components after the click chemistry were identified within N 1s XP spectra as well as with the NEXAFS C K edge. The CF3 groups of the alkynes were identified with XPS C 1s and F 1s spectra as well as the NEXAFS F K absorption edge. Afterwards, the binding of biomolecules was tested by the immobilized biotin/streptavidin system on the surface via click chemistry. The successful biotin/streptavidin interaction was proven with XPS, NEXAFS and ToF-SIMS. We found a solvent effect of the click reaction result with the test alkyne as well as for the immobilization of the biotin/streptavidin film. Additionally, a copper(II)trifluoromethoxy phenanthroline complex used as an artificial nuclease was immobilized on surface aminogroups via amide coupling. Here, an OCF3 substituent serves as XPS marker for easy detection. The complex was identified with the help of C 1s, F 1s and Cu 2p XP spectra, with NEXAFS C K- and F K-edge spectra as well as ToF-SIMS spectra. The amount of immobilized copper on the surface was determined with ICP-MS to be 0.08 µg/cm2 (87 x 1012 copper atoms per cm2). After the verification of the immobilized complex, the DNA cleavage activity of the artificial nuclease against plasmid DNA was investigated. Here, an increased nuclease activity was observed with increased incubation time. Furthermore, it is remarkable that the used copper(II) complex reached its cleavage activity only as surface-bond species. While the complex in solution did not show any cleavage activity in control experiments.