Entwicklung und Testung von multigenen, multivektoriellen Impfstoffen gegen das humane und simiane Immundefizienzvirus

Abstract

Die HIV-1 Infektion, und die damit verbundene AIDS-Erkrankung stellt seit der Pest die größte pandemische Gesundheitsbedrohung der Menschheit dar. Obwohl diese schon seit fast 30 Jahren bekannt und seitdem im Fokus der Impfstoffentwicklung ist, konnte bislang kein wirksamer Impfstoff entwickelt werden. Der vorherrschende wissenschaftliche Optimismus nach der Identifikation des Auslösers des erworbenen Immundefizienzsyndroms in Bezug auf die schnelle Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes fand nach ungefähr einer Dekade des Scheiterns klassischer Impfstoffkonzepte ein ernüchterndes Ende. Infolge dieser Problematik und grundlegenden wissenschaftlichen Fortschritten wurden vielfältige neuartige Immunisierungsstrategien, hauptsächlich auf Basis rekombinanter Proteine und genetischer Impfstoffe, entwickelt und in unzähligen präklinischen und klinischen Studien getestet. Leider spiegelt sich die einzigartige Natur und Pathologie von HIV-1 auch hier in großen Hürden bei der Entwicklung eines effektiven modernen Impfstoffes wider. Die fehlende Kenntnis immunologisch protektiver Mechanismen, die außerordentlich hohe Virusdiversität, die rapide Entwicklung latenter Virus- reservoire sowie von Fluchtmutanten infolge immunologischen Selektionsdruck, die virusbedingte Modulation wichtiger immunologischer Funktionen, die gezielte Infektion und Depletion der für die adaptive Immunantwort essentiellen T-Helferzellen sowie die Probleme der Induktion und Effektivität neutralisierender Antikörper stellen in dieser Kombination und Komplexität eine bislang nie dagewesene Heraus-forderung dar. Mithilfe der, seit ungefähr Mitte der neunziger Jahre in Tiermodellen durchgeführten genetischen Immunisierung konnten bislang auf Basis von HIV oder anderer Virus- bzw. Tumorerkrankungen zum Teil sehr vielversprechende Ergeb-nisse erzielt werden. Die gewonnenen Erfahrungen aus diesen Tierstudien und Untersuchungen von Personen mit einer ausgeprägten Resistenz vor HIV-Infektion oder AIDS- Progression stärkten die Bedeutung einer virusspezifischen, zellulären Immunantwort vorrangig zytotoxischer T-Zellen, nachhaltig. Infolge dessen wurden eine Vielzahl genetischer Immunisierungsvektoren und –regime entwickelt und getestet. Mit den zunehmenden Fortschritten wurden Probleme bei der Übertragung von in Tiermodellen erzielten Ergebnissen auf klinische Studien in Menschen deutlich. So wurden um HIV-Impfstoffe direkt im Makkaken- Belastungsmodell testen zu können, chimäre SHIV-Belastungsviren entwickelt und in Effizienzstudien ver-wendet. Die mangelhafte Aussagekraft der Ergebnisse des SHIV-Makkaken Modells gipfelte letztendlich in dem vorzeitigem Abbruch einer darauf initiierten großen klinischen Effizienzstudie. Darüber hinaus wurden in dieser und weiteren klinischen Studien Schwierigkeiten in Bezug auf die vergleichsweise geringe Immunogenität der verwendeten Impfstoffe deutlich. Als mögliche Ursache für diese Unterschiede kommen vorrangig eine präexistente Vektorimmunität und Schwierigkeiten bei der Skalierbarkeit von genetischen, vor allem DNA-basierten Impf- bzw. Applikations-methoden in Frage. Die hohe genetische Heterogenität menschlicher Probanden, insbesondere in Bezug auf den HLA-Haplotypen, ist ein weiterer Faktor, der erst neuerdings verstärkt bei der Durchführung von Makkaken-Studien berücksichtigt wird. Mithilfe der Erfahrungen aus den unzähligen Publikationen zu dem Thema HIV-Impfstoffe in den letzten Jahrzehnten und den damit verbundenen Problemen haben wir versucht, eine rationale Immunisierungsstrategie zu entwickeln, um einen möglichst großen Teil dieser Problematik zu berücksichtigen. Hierfür wurde ein multigenes, multivektorielles genetisches Immunisierungsregime, basierend auf DNA GeneGun-Vektoren, rekombinanten Adenoviren des Serotyps 5 und rekombinanten Adeno assoziierten Viren des Pseudotyps 9 entwickelt. Obwohl bekannt ist, dass heterologe Immunisierungsregime die Immunogenität deutlich steigern können, einer Vektorimmunität entgegenwirken und die Eignung der einzelnen Vektoren für Immunisierungen bereits mehrfach gezeigt werden konnte, ist nach unserem Wissen keine Arbeit publiziert, in der alle drei Vektorsysteme kombiniert wurden. Eine zusätzliche Steigerung der Immunogenität sollte durch bekannte Methoden, wie die Codonoptimierung der DNA-Sequenzen, und mithilfe eines genetischen GMCSF-Adjuvants erzielt werden. Um dem Problem der hohen Virusdiversität zu begegnen, haben wir uns für die Verwendung einer HIV Klade B Konsensussequenz entschieden. Diese Art regionspezifischen Impfstoffs stellt zwar einen Kompromiss dar, ist jedoch nichtsdestotrotz ein adäquates Mittel, um dem Problem der Diversität zu begegnen. Um die Möglichkeit einer späteren Effizienztestung der entwickelten Immunisierungsstrategie unter Verwendung des am besten geeigneten SIV /Makkaken-Modells zu haben, wurden parallel zu den HIV-1 Impfvektoren SIVmac239 Impfvektoren auf die gleiche Weise entwickelt und vergleichend auf deren Eigenschaften im Mausmodell getestet. Die Evaluation der verschiedenen homologen und heterologen zweifachen und dreifachen Immunisierungsregime zeigte für die HIV und SIV Impfstoffe deutlich die Überlegenheit von dreifachen, heterologen Immunisierungen in Bezug auf die Stärke der induzierten zellulären Immunantwort und die Anzahl erkannt antigener Epitope. Die gemessenen zellulären Immunantworten von annähernd 30000 reaktiven T-Zellen pro Million Splenozyten und bis zu 15 reaktiven Epitopen im Gag und Pol Antigen, waren deutlich höher als erwartet und übertreffen die Werte aus erfolgreichen Immunisierungs- und Belastungsversuchen mit Influenza, LCMV, SARS oder Tumorzellen deutlich. Untersuchungen der induzierten humoralen Immunantwort zeigten einen Trend der Steigerung der Antikörperproduktion bei Verwendung von rAAV9 Vektoren, weitgehend unabhängig von der Anzahl oder der Kombination der Immunisierungen. Die gemessene Stärke der zellulären Immunantwort, die Anzahl der erkannten Epitope sowie die beobachteten Trends ähnelten sich für die HIV- und SIV-Immunisierungen weitgehend. Eine abschließende Untersuchung der in vivo Zytotoxizität dieses optimalen dreifach heterologen HIV- und SIV-Immu-nisierungsregime konnte die Funktionalität der induzierten Immunantwort eindeutig bestätigen. Immunisierte Mäuse waren in der Lage, 88-98 % der injizierten syngenen Splenozyten, welche mit je einem immundominanten Gag-Peptid markiert wurden, innerhalb von zwölf Stunden zu lysieren. Die hervorragenden Eigenschaften dieses neuartigen multigenen DNA/rAd5/rAAV9 Immunisierungsregimes in Bezug auf die Induktion einer äußerst starken, breit-gefächerten und funktionellen zellulären Immunantwort zeichnen dieses als einen interessanten Kandidaten für weiterführenden Makkakenstudien aus. Mehrere, gegen Ende dieser Arbeit publizierte vielversprechende Immunisierungs- und Belastungsversuche in Makkaken unterstützen die Bedeutsamkeit dieses Immunisierungskonzeptes eindeutig und könnten einen Schritt in Richtung eines wirksamen HIV-Impfstoffes beitragen.

Despite being the focus of vaccine research for almost 30 years, an effective vaccine against HIV/AIDS, a pandemic that perhaps poses the greatest threat to human health since the Black Death, remains elusive. The scientific optimism for the rapid development of an effective vaccine that prevailed following the initial identification of the pathogen causing AIDS disappeared within a decade as the classical approaches to vaccine production continuously failed. As a result of these problems and based on the scientific advances of the time, a wide range of novel immunisation strategies, based mainly on recombinant proteins and genetic vaccines, were developed and evaluated in numerous preclinical and clinical studies. Unfortunately, the unique nature and pathology of HIV-1 imposes major hurdles to the development of an effective, modern vaccine. Critically, knowledge is lacking of a protective immune mechanism and factors such as the extraordinarily high degree of virus diversity, the rapid development of latent virus reservoirs and of escape mutants as a result of immunological selective pressure, the modulation by the virus of critical immunological functions, the targeted infection and depletion of the helper T-cells essential for an adaptive immune response, as well as the problems with the induction and efficacy of neutralising antibodies, present, in this combination and complexity, a previously unknown challenge. More recently, promising results have been generated with HIV, other viruses and cancers using the technique of 'genetic immunisation' established in the mid-1990s. The experience gained from these animal studies and studies involving humans that have an exceptional resistance to HIV- infection or AIDS progression continue to support the conclusion that virus- specific, predominantly cytotoxic T-lymphocytes can be effective. As a result, many genetic vaccine vectors and regimes have been developed and tested. It became increasingly clear that there are major problems in transferring the results from the animal model to human clinical trials. To enable HIV vaccines to be tested directly in the macaque challenge model, chimeric SHIV challenge viruses were developed and used in efficacy trials. However, the poor relevance of results from the SHIV model for the situation in humans came into sharp focus when a large clinical trial initiated partially in response to results with the SHIV/macaque model was abandoned due to an unexpected higher rate of infection in vaccinees. Furthermore, this and other clinical studies revealed the poor immunogenicity of the vaccines being tested. Possible reasons for these differences were predominantly the presence of pre-existing anti-vector immunity and problems with the scale-up of genetic vaccines, particularly those based on DNA, and their method of application. The high genetic heterogeneity of human test subjects, particularly with regard to HLA- haplotypes, is another factor that is only recently being taken into account during macaque studies. Based on the experience and countless publications concerning HIV vaccine development and its problems over the preceding decades, we attempted to develop a rational immunisation strategy that took these problems into account. Therefore, a multigenic, multivector genetic immunisation regime, based on gene-gun vectors (DNA), recombinant adenovirus type 5 (rAd5) and recombinant adeno-associated virus pseudotype 9 (rAAV9) was developed. Although it is known that a heterologous immunisation regime can greatly enhance immunogenicity, that it can eliminate the inhibitory effects of vector immunity and that the suitability of the individual vectors has been demonstrated many times, no publication has yet included a combination of all three vector systems. It was also decided to provide an additional boost in immunogenicity by using methods such as codon-optimisation of the DNA sequence and the use of a genetic form of GMCSF as adjuvant. To avoid problems with the high diversity of HIV we decided to base the HIV vaccine on a clade B consensus sequence. Although this form of region-specific vaccine represents a compromise, it is nevertheless a promising approach to tackling the problem of diversity. To allow subsequent efficacy trials in the relevant SIV/macaque model, we developed in parallel to the HIV constructs vaccines based on SIVmac239 and compared their immunogenicities in mice. The evaluation of different homologous and heterologous double- and triple-immunisation regimes demonstrated for both the HIV and SIV vaccines a clear superiority for triple, heterologous vaccination, with regard to the strength of the cellular immune response induced and the number of antigen epitopes recognised. The cellular immune responses, with almost 30000 reactive T-cells per million splenocytes and up to 15 reactive epitopes in Gag and Pol, were far higher than expected and significantly exceed those reported in successful immunisation/challenge studies with influenza, LCMV, SARS and tumor cells. Investigations of the induced humoral immune responses demonstrated a trend for increasing antibody production using rAAV9 vectors, largely independently of the number or combination of the immunisation. The strength of the cellular immune response, the number of epitopes recognised and the trends observed were similar for the HIV and SIV vaccines. A concluding evaluation of the in vivo efficacy of the optimal triple, heterologous HIV and SIV immunisation regime confirmed the functionality of the immune responses induced. Immunised mice were able, within twelve hours, to eliminate 88-98% of injected, syngeneic splenocytes pulsed with an immunodominant Gag peptide. The impressive properties of this new multigenic DNA/rAd5/rAAV9 immunisation regime, with regard to the extremely strong, broad and functional cellular immune response, make this an interesting candidate for subsequent macaque studies. A number of immunisation/challenge macaque studies published towards the end of this project support the significance of this immunisation concept and could contribute to the eventual development of an effective AIDS vaccine.