Der Einfluss von TNF-α-Inhibitoren auf den Ischämie-/Reperfusionsschaden und assoziierte Inflammationsreaktionen in der Dünndarmtransplantation

Abstract

Die Transplantation ist die einzige kurative Therapie des irreversiblen Kurzdarmsyndroms. Trotz guter Einjahres-Überlebensraten sind die Langzeitergebnisse jedoch unbefriedigend. Hauptursache hierfür ist die chronische Allograftenteropathie. Sie ist einerseits durch antigen-abhängige Immunreaktionen (akute und chronische Abstoßung); andererseits durch antigen- unabhängige Faktoren wie den Ischämie-/Reperfusionsschaden (I/R-Schaden) bedingt. Zur Eliminierung der antigen-unabhängigen Faktoren wird langfristig die Reduktion des I/R-Schadens angestrebt. Eine im Tiermodell vielversprechende Therapie hierfür ist der Einsatz von TNF-α-Inhibitoren wie Infliximab, Etanercept und Pentoxiphyllin. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss der perioperativen pharmakologischen Blockade der TNF-α-Aktivität auf den Ausprägungsgrad des I/R-Schadens, die assoziierte Inflammationsreaktion sowie die Schädigung von zusätzlichen Organen wie der Empfängerlunge. Im etablierten, syngenen Lewis-/Lewis Transplantationsmodell, in dem keine Abstoßungsreaktion stattfindet, wurde eine orthotope Dünndarmtransplantation durchgeführt, der eine kalte Ischämiezeit von sechs Stunden vorausging. Es wurden drei Empfängergruppen gebildet, die perioperativ jeweils einen der drei TNF-α-Inhibitoren erhielten. Zwei zusätzliche Tiergruppen dienten als Kontrollen. In der ersten davon wurde eine Transplantation durchgeführt, jedoch fand hier keine Therapie statt. Die Tiere der nativen Kontrollgruppe wurden weder transplantiert noch wurde diese Gruppe medikamentös behandelt. Nach einer Beobachtungszeit von 12 Stunden, 7 Tagen oder 6 Monaten wurden die Empfängertiere getötet und die Transplantate sowie die mesenterialen Empfängerlymphknoten und eine Empfängerlunge entnommen. Zusätzlich wurde intraoperativ 20 Minuten nach Reperfusion ein Segment von proximalem und distalem Dünndarmtransplantat entnommen. Am Ende der Beobachtungszeiten wurden die gewonnenen Transplantate histomorphologisch sowie immunhistochemisch hinsichtlich der Expression der Antigene CD4, CD8 und CD25 sowie ED1, OX62, OX3 und HSP-70 untersucht. Die Zytokinkonzentration von TNF-α, IL-6 und IL-4 wurde in den mesenteriallen Lymphknoten und den Transplantaten mit Hilfe eines ELISA-Assays bestimmt. Zusätzlich wurden der Grad der Apoptose in den Transplantaten und die MPO-Aktivität im Parenchym der Empfängerlunge mittels TUNEL- bzw. MPO-Färbung quantifiziert. Nach einer einmaligen Infliximab-Gabe überlebten 100% der Versuchstiere den Beobachtungszeitraum von 7 Tagen. In den unbehandelten DTx-Kontrollen war das Überleben signifikant schlechter. Gleichzeitig war der histomorphologische Organzustand in den behandelten Transplantatgruppen signifikant besser als in den DTx-Kontrollen. Signifikante Reduktion der Anzahl transplantatinfiltrierender CD4+, CD8+ und CD25+ T-Zellen sowie ED1+ Makrophagen und OX62+ dendritischer Zellen zeigte sich nach TNF-α-Blockade insgesamt für alle Zeitpunkte nach der Reperfusion. Interessanterweise wiesen die distalen Transplantatabschnitte signifikant höhere Frequenzen der infiltrierenden Leukozyten auf, was mit klinischen Beobachtungen korreliert. Des Weiteren war die Akkumulation des zytoprotektiven Markers HSP-70 nur nach einer Behandlung mit Infliximab signifikant verstärkt. Durch die Applikation von TNF-α Inhibitoren verminderte sich der Grad der Apoptose im distalen Transplantatabschnitt im Vergleich zu den DTx-Kontrollen. In der Empfängerlunge war nach einer Hemmung der TNF-α-Aktivität eine signifikant geminderte Infiltration mit MPO+ neutrophilen Granulozyten nachweisbar. Im TNF-α-Zytokinmuster der mesenterialen Lymphknoten der behandelten Tiere war eine Tendenz zu reduziertem Spiegel gegenüber der Vergleichsgruppe zu verzeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass I/R-Schaden und Inflammation nach Empfängerbehandlung mit TNF-α-Inhibitoren bei der Dünndarmtransplantation signifikant reduziert sind. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass mit einer anti-TNF-α-Therapie eine signifikante Besserung von Überleben und Lungenprotektion beim Empfänger erzielt werden kann.

Small bowel transplantation is the only curative therapy for irreversible short bowel syndrome. In spite of improvement of short term survival there is constant graft loss on the long term with chronic allograft enteropathy being the main cause for this phenomenon. This process is on one hand caused by antigen-dependent alloimmunity (i. e. acute and chronic rejection). On the other side antigen-independent processes like ischemia/reperfusion injury ( I/R injury) play also a major role in mediating chronic allograft enteropathy. Thus, TNFα-Inhibition with infliximab, etanercept and pentoxifylline could be a promising therapeutic concept to mitigate the process of ischemia/reperfusion injury in the scope of small bowel transplantation. The present work examines the influence of different TNFα inhibition concepts on reducing ischemia/reperfusion injury, associated inflammatory responses and injury to distant organs (i. e. recipient lung) in rat intestinal transplantation. Orthotopic small bowel transplantation was performed in an isogenic model in male Lewis rats. Grafts were flushed with UW solution and stored for 6 hours at 4°C before implantation. The TNFα inhibitor groups received either infliximab, etanercept or pentoxifylline. Controls received no further treatment. Tissue samples of proximal and distal graft and mesenteric lymph nodes were taken 20 minutes, 12 hours, 7 days and 6 months after reperfusion for histopathology (H&E; stain), immunohistology (CD4, CD8, CD25, ED1, OX62, MHCII and HSP70 ), TUNEL assay (graft apoptotic cell death) and ELISA (TNF-α, IL-6 and IL-4). Lung sections were stained for Myeloperoxidase (MPO, specific staining of neutrophil granulocytes). Seven day survival was significantly improved following TNFα inhibition with infliximab. Beyond POD 7 survival was 100% in all groups. TNFα inhibition significantly decreased I/R injury in all treatment groups. Histological signs of I/R-injury as well as the number of graft infiltrating T cells (CD4+, CD8+, CD25+) and ED1+ monocytes/macrophages (immunohistology) displayed significant reduction over the whole observation period, thus being most pronounced following treatment with infliximab. Accumulation of cytoprotective markers (HSP-70) was significantly enhanced after TNF-α blockade with infliximab as well. Moreover, MPO stain revealed a significant reduction of neutrophil infiltration of the lung following TNFα inhibition. However, graft damage and cellular infiltrates were significantly enhanced in distal vs. proximal graft portions in all groups. Albeit reduced markedly, this difference even persisted after TNFα inhibition. This study demonstrates that short-term as well as long-term consequences of I/R-injury after rat intestinal transplantation were significantly reduced by TNFα inhibitors. Furthermore, it was shown that TNFα inhibition improves recipient survival and minimizes injury to distant organs.