Untersuchungen und Differenzierung der beteiligten Mechanismen der renalen Durchblutungsautoregulation bei der Spezies Maus durch die Sprungantwort

Abstract

1\. Die Niere kann ihren Gefäßwiderstand bei Änderungen des renalen arteriellen Druckes so einstellen, dass der renale Blutfluß und die glomeruläre Filtrationsrate in einem weiten Bereich des Blutdruckes annähernd konstant bleiben. Dies nennt man renale Autoregulation. An ihr sind im wesentlichen die myogene Antwort der präglomerulären Gefäße und die tubuloglomeruläre Rückkopplung (TGF) beteiligt.

2\. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, zunächst ein Mausmodell für die Untersuchung der Autoregulation zu etablieren. Es wurden verschiedene Wildtyp- Mausstämme in die Untersuchungen mit dem Ziel einbezogen, die autoregulatorischen Fähigkeiten in Mäusen zu analysieren. Mäuse ohne endotheliale Stickoxidsynthase sowie solche mit Endothelin-Überproduktion (ET-1 überexpremierende Mäuse) wurden verwendet, um einen Beitrag zur Aufklärung der einzelnen Mechanismen der Autoregulation zu leisten. Dabei interessierte uns, wie sich die Autoregulation bei Blockade des TGF, des Stickoxidsystems und bei Endothelin- überproduktion verändert.

3\. Mäuse wurden narkotisiert und instrumentiert. Die Messung des renalen Blutflusses (RBF) erfolgte durch einen Ultraschallmesskopf. Die Flüsse im Kortex und in der Medulla wurden mittels Laser-Dopplers erfaßt. Der renale Perfusionsdruck (RPP) konnte unter Verwendung einer Drossel, die um die subphrenische Aorta gelegt wurde, eingestellt werden. Dazu wurde eine Servossystem entwickelt. Der Blutdruck in der abdominalen Aorta unterhalb der Drossel wurde gemessen und durch Bedienung der Drossel auf dem vorgegebenen Wert gehalten bzw. entsprechend des Protokolls geführt. Die autoregulatorischen Fähigkeiten der Niere wurden durch Applikation von rampenförmigen und sprungartigen Änderungen des renalen Blutdruckes untersucht.

4\. Statische und dynamische Untersuchungen der RBF-Autoregulation unter langsamer rampenförmige oder sprunghafter Änderung des RPP sind im Mausmodell gut durchführbar. Neben Aussagen über die Lage der Autoregulation bei gängigen Mausstämmen (NMRI, C57BL6), die zwischen 40 mmHg bis 75 mmHg liegt und damit im Vergleich zu Ratten oder Hunden deutlich niedriger ist, konnten aus dem RBF-Schwingungsverhalten Kenndaten der beteiligten Mechanismen der RBF- Autoregulation gewonnen werden. Übereinstimmend mit den Literaturangaben bei Untersuchungen an Ratten und Hunden wurden unter Ausgangsbedingungen auch im RBF-Autoregulationsverhalten an der Mausniere ein myogener Mechanismus mit einer Schwingungsdauer um 7 s, der TGF mit einer Schwingungsdauer um 47 s sowie ein metabolisch gesteuerter Mechanismus mit einer Schwingungsdauer um 200 s identifiziert. Diese Mechanismen ließen sich auch im RBF- Autoregulationsverhalten im transgenen Mausmodell unter Überexpression von ET-1 darstellen. Differenzen ergaben sich in der unterschiedlichen Aktivität der Mechanismen, messbar am Amplitudenquadrat der einzelnen Schwingungen, das bei den ET-1 überexprimierenden Mäusen nicht so groß ist wie bei den Kontrolltieren.

5\. Volumenexpansion mit isotoner Kochsalzlösung führte nur bei den Kontrollmäusen zu einem Anstieg des RBF bei unverändertem Blutdruck. Die mit der Volumenexpansion verbundene shear stress-Erhöhung veränderte nicht die Schwingungsdauer des myogenen Mechanismus oder des TGF bei ET-1 überexpremierenden Mäusen und Wildtypmäuse. Die ET-1 überexpremierenden Mäuse verhalten sich unter Volumenexpansion mit isotoner Kochsalzlösung wie Ratten unter Volumenexpansion mit Vollblut, das heißt, es kommt zu einem Anstieg des Systemblutdrucks bei näherungsweise konstantem RBF. Ursache für dieses Verhalten könnte die herabgesetzte Empfindlichkeit sowie Reaktionsgeschwindigkeit des Endothels der ET-1 überexpremierenden Mäuse auf Änderung der Wandspannung sein, verbunden mit einer gestörten endothelialen Stickoxid(NO)-Freisetzung. Die in der Literatur beschriebene erhöhte Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) bei den ET-1 überexpremierenden Mäusen unterdrückt möglicherweise die endotheliale (eNOS) und neuronale Isoform der NOS (nNOS).

6\. Bei unspezifischer Hemmung der NO-Synthasen durch L-NAME nach Volumenexpansion kam es zu einer signifikanten Verlängerung der Schwingungsdauer des myogenen Mechanismus bei ET-1 überexpremierenden Mäuse und Wildtypmäusen. Dieses Verhalten könnte Ausdruck einer NO-abhängigen Reaktionsfähigkeit der Tonusregulierung der renalen Gefäße sein, die sich nach Blockade der NO-Synthasen durch L-NAME in einer Verlängerung der Schwingungsdauer äußert. Bei den Kontrolltieren kam es unter Volumenexpansion (shear stress-Erhöhung) zu einer Abnahme der Schwingungsdauer des metabolisch gesteuerten Anteils der Autoregulation. Bei Volumenexpansion mit anschließender L-NAME Gabe verlängerte sich die Schwingungsdauer jedoch. ET-1 überexpremierenden Mäuse zeigten dagegen ein umgekehrtes Verhalten der Schwingungsdauer unter den genannten Versuchsbedingungen. Interpretationsversuche schließen eine Freisetzung unterschiedlicher Metabolite bei ET-1 überexpremierenden Mäusen und Wildtypmäusen ein, welche die Reaktionsfähigkeit der renalen Widerstandsgefäße entsprechend modifizieren.

7\. Deutliche Unterschiede wurden auch in Bezug auf die Aktivierungszustände der einzelnen Autoregulationsmechanismen im Vergleich von ET-1 überexpremierenden Mäusen und Wildtypmäusen unter den verschiedenen Versuchsbedingungen beobachtet. Volumenexpansion führte zu einer fast vollständigen Hemmung des TGF bei den Wildtypmäusen, jedoch nicht bei den ET-1 überexpremierenden Mäusen. Eine zunehmende Aktivierung des metabolisch gesteuerten Mechanismus war unter Volumenexpansion in beiden Gruppen zu beobachten, während der myogene Mechanismus abgeschwächt war. Die Gabe von L-NAME unter Volumenexpansion führte zu einer Aktivierung des myogenen Mechanismus und des metabolisch gesteuerten Mechanismus in beiden Gruppen.. Hervorzuheben ist hier die deutlich stärkere Aktivierung des myogenen Mechanismus bei den Wildtypmäusen. Eine neue Möglichkeit zur Beurteilung der Regulationsgeschwindigkeit des RBF bei Sprungantworten stellt die Bestimmung der Zeitkonstante dar, d.h. die Zeit, die bis zum Erreichen von 66 % des Ausgangsblutflusses nach induzierter Sprungantwort des RPP benötigt wird. Diese ist bei den ET-1 überexpremierenden Mäusen nach Volumenexpansion im Vergleich zu den Wildtypmäusen signifikant erhöht.

8\. Mit der vorliegenden Arbeit konnte in verschiedenen Wildtypmäusen gezeigt werden, dass drei Mechanismen, nämlich die myogene Antwort der Gefäße, der TGF und eine metabolische Komponente an der Autoregulation beteiligt sind. Der untere Grenzbereich der Autoregulation liegt in unseren Experimenten bei niedrigeren Drücken als bei den Spezies Hund und Ratte. Ferner konnte anhand der ermittelten Kenndaten der einzelnen Mechanismen der RBF-Autoregulation (Schwingungsdauer, -größe) dargelegt werden, dass Tiere mit ET-1-Überexpression auf Manipulationen des Systems durch NOS-Blockade und Volumenexpansion stark differente Reaktionsmuster aufweisen, die auf komplexe Interaktionen der beteiligten Systeme bei der Autoregulation der Niere hinweisen. Neben dem erhöhten ET-1 in der Niere können hierfür auch Funktionsänderungen anderer vasoaktiver Systeme infolge der chronischen Überexpression von ET-1 verantwortlich sein. Die hier etablierte Methode ermöglicht neue Einblicke in die Details der Regulationsmechanismen des renalen Blutflusses durch Studien an anderen zunehmend zur Verfügung stehenden Mausmodellen.

The aim of the study was to establish a method to investigate the renal blood flow (RBF) autoregulation in mouse. Furthermore we investigated the role of endothelin-1 (ET-1) in mice with over expressing of ET-1 and endothelial NO synthase knockout (eNOS) mouse in RBF-autoregulation. Response of renal vasculature to changes in renal perfusion pressure RPP) involves mechanisms with different frequency characteristics. Autoregulation of renal blood flow (RBF) is mediated by the rapid myogenic response, by the slower tubuloglomerular feedback (TGF) mechanism, and, possibly, by an even slower third mechanism. To evaluate the range of RBF autoregulation and individual contribution of these mechanisms to RBF autoregulation, we analyzed the response of RBF, cortical (LFC) and medullar (LFM) Doppler-laser flow to a step increase (ET-1 mouse vs. littermate) and slow decrease with following increase in RPP in mice (NMRI, ET-1, littermate, eNOS knockout,C57Bl6). To investigate the influence of chronic endothelin-1 expression on the RBF autoregulation mechanism, we used different conditions 1) control (C),2) volume expansion (VE) an 3) VE with L-NAME (VE+ L-NAME). METHOD: In anesthetized mice (ET-1 mice, littermate) the suprarenal aorta was occluded for 30 s , and then the occlusion was released to induce a step response in RPP. Afterwards we decrease the RPP from spontaneous RPP to 20 mmHg over 1440s an increase the RPP over 1440s. We evaluate the relative renal conductance of LFC, LFM, RBF and the maximum of the relative renal conductance as well as the adjacent RPP to characterize the range and lower limit of autotegulation. To characterize the mechanisms of RBF autoregulation through step response in RPP, we used a mathematic model. RESULTS: The range of autoregulation for the investigated mice (NMRI, ET-1, littermate, eNOS knockout, C57Bl6) is between 40 mmHg to 75 mmHg. Three dampened oscillations were identified in ET-1 mouse and littermates; their oscillation periods about 7 s for myogenic mechanism, 47 s for TGF, and 100s to 200s for the third metabolic mechanism. VE showed no change in oscillation period in ET-1 mice or littermates. Furthermore VE with isotonic NaCL showed in littermates an increase in RBF, but have no influence on the arterial pressure (AP), whereas the ET-1 mice showed an increase in AP and no influence on RBF. They reacted like rats under VE with whole blood. Under VE in littermates the oscillation period of third mechanism was shortened and extended under VE + L-NAME. ET-1 mice showed inverse behaviour under these conditions. Furthermore VE effected an inhibition of TGF in littermates and correspond with previously reported data. In accordance, after VE, the amplitude of the intermediate oscillation (TGF) was significantly reduced, but less in ET-1 mice. After VE+L-NAME we observed a significantly increased the amplitude of the 10-s oscillation in ET-1 mice and littermates. Also we observed under these conditions an increase of activity of the third metabolic mechanism. A new possibility to describe the velocity of a system is the time constant. It is reduced in ET-1 mice vs. littermates after VE. CONCLUSIONS: Characterization of RBF autoregulation is possible in mouse. The range of RBF autoregulation in mice is lower than in rat or dog. It is concluded that the parameters of the dampened oscillations induced by the step increase in RPP reflect properties of autoregulatory mechanisms. The oscillation period characterizes the individual mechanism and the square of the amplitudes characterizes the power of the respective mechanism. In addition to the myogenic response and the TGF, a third rather slow mechanism of RBF autoregulation exists. ET-1 mice showed a different RBF autoregulation in TGF than littermates. A reason could be an altered perception of shear stress as a result of inhibition of endothelial NO synthase (eNOS) and neuronal NO synthase (nNOS) through inducible NO synthase (iNOS) that previously reported data showed

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