Mechanismen und (patho)physiologische Konsequenzen einer sauerstoffabhängigen Regulation des TrkB-Neurotrophinrezeptorgens

Abstract

Hypoxische TrkB-Expression in vitro: Neurotrophine und ihre Rezeptoren spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung und Funktion des Nervensystems. Hohe Expressionsniveaus des Neurotrophinrezeptors TrkB und seiner Liganden sind in Neuroblastomen mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass das für die Rezeptortyrosinkinase TrkB kodierende Gen NTRK2 in verschiedenen Zelllinien sauerstoffabhängig reguliert ist und durch den Hypoxie-induzierbaren Faktor-1 (HIF-1) stimuliert wird. Die mRNA und –Proteinniveaus von TrkB waren in der Neuroblastom-Zelllinie Kelly unter Hypoxie (1 % O2) vs. Normoxie (21 % O2) ca. 28-fach erhöht. Ein Luziferase-Reporterkonstrukt, das ca. 2,1 kbp des humanen TrkB-Promotors enthielt, wurde unter Hypoxie und nach Stimulation mit dem Hypoxiemimetikum 2,2’-Dipyridyl (DP, 100 µM) bei 21 % O2 ca. 6-fach stärker abgelesen. Die Luziferaseaktivität in der Anwesenheit von DP war durch RNA-Knockdown mit siRNAs gegen HIF-1, nicht aber gegen HIF-2, signifikant reduziert. Entsprechend konnte Hypoxie den TrkB-Promotor in embryonalen Mausfibroblasten, denen HIF-1 fehlte, nicht stimulieren. Die hypoxieresponsive TrkB- Promotorregion konnte auf drei Bindungsstellen für HIF-1 eingegrenzt werden, die sich im Bereich zwischen 923 und 879 bp relativ zur Transkriptionsstartstelle befanden. Die Migration von kultivierten Neuroblastomzellen war durch Inkubation bei 1 vs. 21 % O2 ungefähr verdoppelt. Dieser Hypoxieeffekt wurde durch Weglassen des TrkB-Liganden Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) und den Tyrosinkinase-Inhibitor K252a verhindert. Zusammenfassend könnte die durch Hypoxie verstärkte TrkB-Expression einen kritischen Schalter für die bereits beschriebene Dedifferenzierung von Neuroblastomzellen unter hypoxischen Bedingungen darstellen und Teil der genetischen Adaptation im Rahmen der Tumorprogression sein. Hypoxische TrkB- Expression in vivo: Zur Untersuchung, ob die Expression von TrkB oder anderer Neurotrophinrezeptoren auch in vivo sauerstoffsensitiv ist, wurden Ratten für 6 h entweder bei Normoxie (21 % O2) oder normobarer Hypoxie (8 % O2) exponiert und die Genexpressionsniveaus bestimmt. Das markanteste Ergebnis war eine fast 15-fache Steigerung der TrkB-mRNA in den Lungen hypoxischer Ratten, aber in keinem anderen der untersuchten Organe. Mittels in situ mRNA-Hybridisierung und Immunhistochemie wurden die Basalzellen des Bronchialepithels und die alveolären Epithelzellen als Ort der verstärkten TrkB-Expression unter Hypoxie identifiziert. Der TrkB-Ligand BDNF erhöhte die Acetylcholin(ACh)-induzierte Kontraktionsantwort isolierter Trachealsegmente hypoxischer, nicht aber normoxischer Ratten signifikant. Dieser BDNF-Effekt wurde durch Präinkubation der Gewebeproben mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor K252a und durch mechanische Entfernung des TrkB-exprimierenden Atemwegsepithels aufgehoben, während der Stickoxidsynthase(NOS)-Inhibitor L-Nitroargininmethylester (L NAME, 0,1 mM) den Einfluss von BDNF auf die ACh-induzierte Kontraktion hypoxischer Trachealsegmente verhinderte. Diese Ergebnisse zeigen, dass systemische Hypoxie die Expression des Neurotrophinrezeptors TrkB im Atemwegsepithel stimuliert. Zusätzlich verstärkt die Aktivierung der TrkB-Signalwege durch BDNF unter Hypoxie die ACh-induzierte Atemwegskontraktilität durch einen Mechanismus, der NO erfordert, da er unter Inhibition der NO-Synthasen mit L NAME nicht reproduziert werden konnte.

Hypoxic TrkB expression in vitro: Neurotrophins and their receptors play a critical role in development and function of the nervous system. High expression levels of the TrkB neurotrophin receptor and its ligands in neuroblastoma are associated with a poor prognosis. The present study shows that the TrkB receptor tyrosine kinase-encoding gene NTRK2 is regulated oxygen-dependendly in different cell lines and that it is stimulated by the Hypoxia inducible Factor-1 (HIF-1). In the neuroblastoma cell line Kelly, mRNA and protein levels of TrkB were enhanced approx. 28 fold in hypoxia (1 % O2) vs. normoxia (21 % O2). A luciferase reporter construct that contained approx. 2,1 kbp of the human TrkB promoter was induced approx. 6 fold in hypoxia and after stimulation with the hypoxia mimetic 2,2’-Dipyridyl (DP, 100 µM) at 21 % O2. Luciferase activity in the presence of DP was significantly reduced by RNA knockdown with siRNAs against HIF-1 but not against HIF-2. Likewise, hypoxia was not able to stimulate the TrkB promoter in embryonic mouse fibroblasts which lacked HIF-1. The hypoxia-responsive TrkB promoter region could be confined to three binding sites for HIF-1 which were located to a region between 923 and 879 bp relative to the transcription start site. Migration of cultivated neuroblastoma cells was doubled after incubation at 1 vs. 21 % O2. This hypoxia effect was inhibited by omission of the TrkB ligand Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) and the tyrosine kinase inhibitor K252a. In summary, hypoxia-induced TrkB expression could represent a critical switch for the formerly described dedifferentiation of neuroblastoma cells under hypoxic conditions and be part of the genetic adaptation during tumor progression. Hypoxic TrkB expression in vivo: To investigate whether expression of TrkB or other neurotrophin receptors was oxygen-sensitive in vivo, rats were exposed for 6 h at normoxia (21 % O2) or normobaric hypoxia (8 % O2), respectively, and the gene expression levels were determined. The most striking result was an approx. 15-fold induction of the TrkB mRNA in the lungs of hypoxic rats but in no other organ studied. By the means of in situ mRNA hybridisation and protein immunostaining basal cells of the bronchial epithelium and alveolar epithelial cells were identified as site of the enhanced TrkB expression in hypoxia. The TrkB ligand BDNF enhanced Acetylcholine(ACh)-induced contractional responses of isolated tracheal segments of hypoxic, but not normoxic rats, significantly. This BDNF effect was abolished by preincubation of the tissue samples with the tyrosine kinase inhibitor K252a and ba mechanic removal of the TrkB-expressing airway epithelium while the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor L-Nitro-Arginine Methyl Ester (L NAME, 0,1 mM) inhibited the BDNF effect on the ACh-induced contraction of hypoxic tracheal segments. These results show that systemic hypoxia stimulates expression of the neurotrophin receptor TrkB in the airway epithelium. Additionally, activation of TrkB signalling by BDNF in hypoxia enhances the ACh-induced airway contractility by a mechanism that requires NO as it could not be reproduced when NO synthases were inhibited with L NAME.