Detection of novel serological biomarkers in two neurodegenerative disorders: Morbus Alzheimer and Multiple Sclerosis

Abstract

Neurodegenerative diseases such as Morbus Alzheimer (AD) and Multiple Sclerosis (MS) affect millions of people each year. Since AD is directly related to higher age and human population gets constantly older, a significant increase of AD-cases is to be expected in the next decades. With this, also health policy costs for treatment and patients care will inevitably raise. Both disorders are incurable and characterized by a dramatic decline of life quality, causing heavy burdens to patients, family members and caretakers. Accordingly, both, pharmaceutical industry and academic science undertake great efforts in exploring treatment and diagnostic possibilities. Yet, in both cases, despite many significant achievements, major aspects of disease cause, risk factors or medication alternatives are still unclear. Particularly, differential diagnosis of AD and MS proved to be a notably difficult area. Main disease manifestations like dementia by AD or muscle dysfunctions by MS, are shared by other neurodegenerative disorders and cannot be easily assigned. In addition, biopsying brain or spinal nerve tissue in a living person is not executable. Hence, clinical diagnosis of AD still mainly relies on psychological tests and medical history by proxy. Diagnostic procedures for MS include also MRI and spinal liquor analysis. However, the heterogeneity of the manifold MS-subforms and symptoms is an additional challenge. Thus, novel diagnostic tools, based on biochemical information, are desperately needed. These should allow precise, preferably early diagnosis and with this, better prognostic and therapeutic chances. Blood serum is an ideal medium for diagnostic purposes. Withdrawal can be easily performed and is not harming for patients. Because of its role as a main transport system, it is a precious information carrier about organism’s health status. Furthermore, all major players of the immune system, e.g. specialized cells, antibodies and molecular messengers circulate there. Thus, in the field of autoimmune disorders, many diagnostic platforms are based on detection and analysis of serum autoantibodies. But also diseases, which do not have a distinct autoimmune background, can potentially lead to pathologic changes in the natural autoimmunity. According to my thesis hypothesis, AD is one such example. Although no distinct immunological reasons are currently known, it seems to provoke autoimmune reactions. As massive brain tissue degradation and progressive leakage in the brain blood barrier take place, it can be hypothesized that inflammatory processes lead to autoantibody production in order to eliminate necrotic organic material. Thus, AD patients’ blood sera could feature specific autoantibody patterns, distinguishable from sera of healthy individuals. On the other hand, MS is a classical example of an autoimmune disorder and served here as a comparative reference to AD. Main aim of my work was to analyze AD-, MS- and Healthy blood sera for disease specific autoantigens that could be applied as novel biomarkers for diagnostic purposes. This was done using two different high-throughput screening technologies: protein macroarrays with spotted cDNA expression clones on the one hand and phage display of human full-ORF libraries in combination with a next generation sequencing platform on the other. Five sera from each of the three cohorts were screened on protein macroarrays for reaction against IgG and IgA autoantibodies. For the second screening I generated new phage vector series first, compatible with the Gateway cloning system. Special focus was laid on functional presentation of the full-ORF-polypeptides on phage surface. For this, I implemented all three major E. coli secretion pathways This step led to a considerable expansion of the range of properly folded and presented proteins. On the example of EGFP, I could finally demonstrate usability and functionality of the new vector series. Next, full-ORF phagemid libraries were generated and bio-panning with four-round selections with two sera from each of the three cohorts were performed in a semi-automatic way. Again, autoantigen detection was performed with IgG and IgA sera autoantibodies. DNA from both initial and selected phages was deep sequenced on an Illumina Genome Analyzer platform. In both screenings numerous disease-specific AD- and MS- autoantigens could be identified. Potential candidates with best performances were recombinantly expressed in E. coli and affinity purified. These were finally re-validated with an enlarged set of 20 sera from each cohort, in ELISA assays. In conclusion, my results fully confirmed my initial hypothesis that non-autoimmune disorders like AD evoke autoimmune interactions that are detectable in proteomics-based high-throughput screenings. The novel disease- related autoantigens are potentially promising biomarker candidates for multiparametric diagnostic assays. Furthermore, I could demonstrate that IgA autoantibodies exhibit pronounced immunoreactivity in blood serum and are therefore well-suited for this kind of screenings besides IgG. Finally, I succeeded in adapting the phage display technology for functional presentation of full-ORF polypeptides. The newly generated pYG vector series and human full-ORF-phagemid libraries are valuable resources that can be applied in diverse selections in future.

Millionen von Menschen erkranken jährlich an neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer (AD) und Multiple Sklerose (MS). Aufgrund der direkten Relation zwischen AD und höherem Alter sowie der fortschreitenden Veralterung der Bevölkerung, kann in den nächsten Jahrzehnten eine erhebliche Zunahme an AD-Fällen erwartet werden. Folglich ist auch ein Anstieg der Gesundheitskosten für die Behandlung und Pflege unvermeidlich. Beide Erkrankungen sind nicht heilbar, charakterisieren sich durch eine dramatische Abnahme der Lebensqualität und verursachen schwere Belastungen für Patienten, Familienmitglieder und Pfleger. Entsprechend groß sind die Bemühungen in der pharmazeutischen Industrie und in der akademischen Forschung, neue therapeutische und diagnostische Ansätze zu finden. Trotz zahlreicher bedeutender Entdeckungen sind in beiden Fällen Krankheitsursachen, Risikofaktoren und Medikationsalternativen immer noch unklar. Vor allem die Differenzialdiagnose von AD und MS erwies sich als besonders schwierig. Zentrale klinische Manifestationen wie Demenz bei AD oder Muskelfunktionsstörungen bei MS kommen auch bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen vor und sind daher nicht leicht zuzuordnen. Außerdem sind Biopsien aus dem Hirn- oder Rückenmarksgewebe lebender Menschen nicht durchführbar. Daher beruht die klinische AD Diagnose immer noch hauptsächlich auf psychologischen Tests und Angehörigenanamnese. Diagnostische Maßnahmen für MS beinhalten auch MRI und die Analyse der Wirbelsäulenflüssigkeit. Allerdings ist die Heterogenität der unterschiedlichen MS-Subformen und –Symptome eine zusätzliche Schwierigkeit. Somit werden neue, auf biochemische Informationen basierende diagnostische Werkzeuge dringend gebraucht. Diese sollen eine präzise, möglichst frühe Diagnose und damit auch bessere prognostische und therapeutische Perspektiven bieten können. Blutserum ist ein ideales Medium für diagnostische Zwecke. Die Entnahme ist einfach durchzuführen und ist nicht invasiv für Patienten. Als Haupttransportsystem ist Blut ein wertvoller Informationsträger für den Gesundheitsstatus des Organismus. Des Weiteren zirkulieren im Blut alle Hauptkomponente des Immunsystems, wie z.B. spezialisierte Zellen, Antikörper und molekulare Messenger. Auf dem Gebiet der Autoimmunerkrankungen basieren daher viele diagnostische Plattformen auf dem Nachweis und der Analyse von Serum-Autoantikörpern. Aber auch Krankheiten ohne erkennbaren autoimmunen Hintergrund können unter Umständen zu pathologischen Veränderungen der angeborenen Autoimmunität führen. Der Hypothese meiner Dissertation zufolge ist AD ein Beispiel dafür. Obwohl bis dato keine deutlichen immunologischen Zusammenhänge bekannt sind, scheint AD Autoimmunreaktionen auszulösen. Aufgrund des massiven Abbaus des Hirngewebes und der zunehmenden Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke kann vermutet werden, dass Entzündungsprozesse zur Produktion von Autoantikörpern führen, die nekrotisches organisches Material beseitigen. Demzufolge könnten Blutseren von AD Patienten spezifische Autoantikörperprofile aufweisen, die sich von Seren gesunder Probanden unterscheiden lassen. MS ist andererseits ein klassisches Beispiel einer Autoimmunerkrankung und diente hier als Vergleichsreferenz zu AD. Die Hauptaufgabe meiner Arbeit war es, Blut Seren von AD-, MS- und gesunden Probanden auf krankheitsspezifische Autoantigene zu analysieren, die als neue Biomarker für diagnostische Zwecke dienen könnten. Dafür wurden zwei unterschiedliche Hochdurchsatz-Screening Technologien eingesetzt: Protein Macroarrays mit gespotteten cDNA Expressionsklonen und Phagen-Display von humanen full-ORF Bibliotheken in Kombination mit einer Sequenzierungsplattform der nächsten Generation. Fünf Seren aus jeder der drei Kohorten wurden auf Protein Macroarrays auf Reaktivitäten gegen IgG und IgA Autoantikörper gescreened. Für das zweite Screening generierte ich zunächst neue, mit dem Gateway-Klonierungssystem kompatible Phagen-Vektoren. Dabei wurde ein besonderer Fokus auf die funktionale Präsentation der full-ORF- Polypeptide auf der Phagenoberfläche gelegt. Dafür implementierte ich alle drei E. coli Hauptsekretionswege, was zu einer deutlichen Erweiterung der Menge an korrekt gefalteten und präsentierten Proteine führte. Am Beispiel mit EGFP konnte ich schließlich die Verwendbarkeit und Funktionalität der neuen Vektorreihe demonstrieren. Als nächstes wurden full-ORF-Phagen-Bibliotheken generiert und Bio-Panning mit vier Selektionsrunden und zwei Seren aus jeder der drei Kohorten im semi-automatischen Verfahren durchgeführt. Erneut wurden die Autoantigene mit IgG und IgA Autoantikörpern detektiert. Die DNS von Ausgangs-, wie auch von selektierten Phagen wurde mittels der Illumina Genome Analyzer Platform durchsequenziert. Bei beiden Screenings konnten krankheitsspezifische AD- und MS-Autoantigene identifiziert werden. Die potentiellen Kandidaten mit den besten Ergebnissen wurden in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Diese wurden schließlich mit größeren Sätzen von 20 Seren aus jeder Kohorte im ELISA- Experiment re-validiert. Zusammenfassend bestätigen meine Ergebnisse meine Hypothese, dass auch nicht-autoimmune Erkrankungen wie AD autoimmune Interaktionen hervorrufen können, die in Proteomics-basierten Hochdurchsatz- Screenings nachweisbar sind. Die neuen 10 AD und 3 MS Autoantigene sind vielversprechende Biomarker Kandidaten für multiparametrische diagnostische Tests. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass IgA Autoantikörper eine ausgeprägte Immunoreaktivität im Blutserum aufweisen und somit neben IgG sehr gut für Screenings dieser Art geeignet sind. Schließlich gelang es mir, die Phagen Display Technologie für die funktionale Präsentation von full-ORF- Polypeptiden zu adaptieren. Die neu generierte pYG Vektorreihe und die humanen full-ORF-Phagemid-Bibliotheken sind wertvolle Ressourcen, die zukünftig in verschiedensten Selektionen eingesetzt werden können.