dc.contributor.author
Kucharzak, Ramón
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:41:38Z
dc.date.available
2007-06-08T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7023
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11222
dc.description
Titlepage, Table of Contents, Abstract
1_Introduction
2_Materials_and_Methods
3_Results
4_Discussion
5_Appendix
dc.description.abstract
Allogeneic stem cell transplantation has become an effective treatment for a
number of haematological diseases such as malignant diseases (acute and
chronic leukaemia, myelodysplasia), aplastic anaemia, immune-deficiencies and
inherited metabolic disorders. As a matter of fact, the best donor in terms of
histocompatibility is a familial HLA identical donor, e.g. HLA-identical
sibling. However, most of the patients do not have a suitable familial donor
and grafts from unrelated donors must be used. In recent years stem cells
collected from blood and especially umbilical cord blood cells have been used,
but in most of the cases the source of grafted stem cells is bone marrow. A
main problem is to find a donor compatible for each patient. This is difficult
to achieve due to the large genetic heterogeneity of the Major
Histocompatibility Complex (MHC) immunogenetic system and its variable
distribution in populations. The human MHC are the human leukocyte antigens
(HLA). Large numbers of potential volunteer bone marrow donors are needed.
Today more than eight million donors are registered world wide, more than two-
third of them in 24 European registries. Improving of registries efficiency is
a permanent aim in order to increase the likelihood of finding compatible
donors, with acceptable economic conditions. Therefore in 2001 an EU-funded
project started to find a new strategy to increase the efficiency paired with
a reduction of the cost. This new strategy included to perform a screen for
the present HLA types of the potential donors. Therefore the alleles of the
transplantation relevant HLA genes, HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1, are divided in
two groups, rare and frequent alleles. Frequent alleles are those of which the
15 most frequent HLA haplotypes are made up of. Only donors with a rare HLA
type will undergo a high resolution typing procedure. To perform the HLA type
screening a robust, reliable and easy-to-use method for HLA type estimation at
high throughput level was required. Within this thesis a DNA analysis-based
method was developed that allows a HLA type estimation of given DNA samples at
high throughput. The HLA type identification is based on microhaplotype
genotyping. Microhaplotypes in this term are short DNA sequences of 4 to 5
bases length. The informativity of a microhaplotype is significantly higher
then the sum of informativity of the single base polymorphisms (SNP) the
microhaplotype is made up of. A set of microhaplotype markers was selected
which allows a medium to high resolution identification of the given HLA
types. As the technique to genotype these microhaplotypes the GOOD assay, a
purification free genotyping platform with mass spectrometric detection and
with a high degree of automation, was chosen. In the framework of this thesis
new software tools for microhaplotype selection and data analysis were
developed, which permit a highly flexible setup of this method for other
highly polymorphic regions in the genome. After proof of principle with DNA
samples from the CEPH panel, a HLA type screen at high throughput level with
randomly selected DNA samples from the registries was successfully performed.
de
dc.description.abstract
Die Transplantation von allogenetischen Stammzellen ist eine sehr effektive
Behandlung einer Vielzahl von hämatologischen Erkrankungen, wie malignanten
Erkrankungen (z.B. akute und chronische Leukämie, Myelodysplasia), aplastische
Anämie, Immundefekten und vererbliche metabolische Störungen. Dabei sind
Transplantate von HLA-identischen Spendern aus der Familie (z.B. HLA-
identische Geschwister) am besten geeignet. Jedoch ist in den häufigsten
Fällen kein geeigneter Spender in der Familie vorhanden. In diesen Fällen muss
ein passendes Transplantat bei freiwilligen Spendern, die nicht mit dem
Patienten verwand sind, gefunden werden. In den letzten Jahren wurden immer
öfter die Stammzellen aus dem Blut gewonnen, insbesondere aus dem Blut der
Nabelschnur. Doch die häufigste Quelle ist noch immer das Knochenmark. Das
größte Problem ist das Finden eines geeigneten Spenders. Die Schwierigkeiten
werden hierbei hauptsächlich durch die große genetische Vielfältigkeit des MHC
(MHC = Major Histocompatibility Complex) und seine variable Verteilung über
die Populationen hervorgerufen. Die Moleküle des menschlichen MHCs werden auch
HLA-Moleküle (HLA = Human Leukocyte Antigens) genannt. Zur Abdeckung des
Bedarfs an Transplantaten wird eine große Menge an potentiellen freiwilligen
Knochenmark-Spendern benötigt. Heutzutage sind mehr als acht Millionen Spender
weltweit registriert, davon mehr als zwei Drittel in den 24 europäischen
Registraturen. Die Verbesserung der Effektivität der Registraturen um die
Wahrscheinlichkeit einen geeigneten Spender unter akzeptablen ökonomischen
Konditionen zu finden, ist ein permanentes Ziel. Zu diesem Zweck wurde im
Jahre 2001 ein von der EU finanziertes Projekt begonnen. Das Projekt hatte zum
Ziel eine neue Strategie zu entwickeln, welche es erlaubt die Effektivität der
Registraturen zu verbessern bei gleichzeitiger Senkung der Kosten. Ein Teil
dieser neuen Strategie ist es die potentiellen Spender auf ihre HLA-Typen zu
untersuchen. Hierzu wurden die bekannten Allele der transplantations-
relevanten HLA-Gene, HLA-A, -B und -DRB1, in zwei Gruppen eingeteilt,
frequente Allele und seltene Allele. Als frequente Allele wurden jene
definiert, welche die 15 häufigsten HLA-Haplotypen bilden, die in den am
Projekt beteiligten Registraturen vorkommen. Nur die Spender mit einem
seltenen HLA-Typ sind für die Registraturen von besonderem Interesse und
sollen einer hochauflösenden Typisierung unterzogen werden. Für die
Untersuchung der Spender-DNA ist eine robuste, zuverlässige und einfach zu
verwendende Methode für den Hochdurchsatz erforderlich. Mit der hier
vorgelegten Arbeit wurde eine auf der DNA-Analyse basierende Methode
entwickelt, die eine Bestimmung der HLA- Typen im Hochdurchsatz erlaubt. Die
Identifizierung der HLA- Typen basierte bei dieser Methode auf die
Genotypisierung von Mikrohaplotypen. Mikrohaplotypen sind in diesem Fall kurze
DNA Sequenzen von 4 5 Basen Länge. Der Informationsgehalt von
Mikrohaplotypen ist signifikant höher als die Summe der Informationsgehalte
der separaten Einzelbasenpolymorphismen (SNP = Single Base Polymorphisms) aus
denen die Mikrohaplotypen bestehen. Für die Identifikation von frequenten und
seltenen Allelen wurde ein Satz von Mikrohaplotypen-Marker ausgewählt, die
eine mittlere bis hohe Auflösung in der Identifikation der HLA-Typen erlaubt.
Für die Genotypisierung der Mikrohaplotypen wurde der GOOD Assay gewählt. Der
GOOD Assay ist eine SNP- Genotypisierungsmethode mit massenspektrometrischer
Detektion und hohem Automationsgrad. Im Rahmen der Arbeit wurden neue
Software-Programme entwickelt, die für die Selektion der Mikrohaplotypen-
Marker und der vollautomatischen Daten-Analyse notwendig sind. Diese Programme
erlauben hohe Flexibilität für den Einsatz der neuen Methode für weitere
hochpolymorphe Regionen im Genom (z.B. HLA-C). Abschließend wurde mit der
Methode im Rahmen des Projektes ein HLA Typen Scann im Hochdurchsatz
erfolgreich angewendet.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
HLA Typing by SNP Genotyping
dc.contributor.firstReferee
Professorin Petra Knaus
dc.contributor.furtherReferee
Professor Hans Lehrach
dc.date.accepted
2007-04-27
dc.date.embargoEnd
2007-08-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000003125-5
dc.title.subtitle
A new Method for HLA Typing at High-throughput Level
dc.title.translated
HLA-Typisieren mittel SNP-Genotypisieren
de
dc.title.translatedsubtitle
Eine neue Methode zum HLA-Typisieren im Hochdurchsatz
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000003125
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2007/421/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000003125
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access