HLA Typing by SNP Genotyping: A new Method for HLA Typing at High-throughput Level

Abstract

Allogeneic stem cell transplantation has become an effective treatment for a number of haematological diseases such as malignant diseases (acute and chronic leukaemia, myelodysplasia), aplastic anaemia, immune-deficiencies and inherited metabolic disorders. As a matter of fact, the best donor in terms of histocompatibility is a familial HLA identical donor, e.g. HLA-identical sibling. However, most of the patients do not have a suitable familial donor and grafts from unrelated donors must be used. In recent years stem cells collected from blood and especially umbilical cord blood cells have been used, but in most of the cases the source of grafted stem cells is bone marrow. A main problem is to find a donor compatible for each patient. This is difficult to achieve due to the large genetic heterogeneity of the Major Histocompatibility Complex (MHC) immunogenetic system and its variable distribution in populations. The human MHC are the human leukocyte antigens (HLA). Large numbers of potential volunteer bone marrow donors are needed. Today more than eight million donors are registered world wide, more than two- third of them in 24 European registries. Improving of registries efficiency is a permanent aim in order to increase the likelihood of finding compatible donors, with acceptable economic conditions. Therefore in 2001 an EU-funded project started to find a new strategy to increase the efficiency paired with a reduction of the cost. This new strategy included to perform a screen for the present HLA types of the potential donors. Therefore the alleles of the transplantation relevant HLA genes, HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1, are divided in two groups, rare and frequent alleles. Frequent alleles are those of which the 15 most frequent HLA haplotypes are made up of. Only donors with a rare HLA type will undergo a high resolution typing procedure. To perform the HLA type screening a robust, reliable and easy-to-use method for HLA type estimation at high throughput level was required. Within this thesis a DNA analysis-based method was developed that allows a HLA type estimation of given DNA samples at high throughput. The HLA type identification is based on microhaplotype genotyping. Microhaplotypes in this term are short DNA sequences of 4 to 5 bases length. The informativity of a microhaplotype is significantly higher then the sum of informativity of the single base polymorphisms (SNP) the microhaplotype is made up of. A set of microhaplotype markers was selected which allows a medium to high resolution identification of the given HLA types. As the technique to genotype these microhaplotypes the GOOD assay, a purification free genotyping platform with mass spectrometric detection and with a high degree of automation, was chosen. In the framework of this thesis new software tools for microhaplotype selection and data analysis were developed, which permit a highly flexible setup of this method for other highly polymorphic regions in the genome. After proof of principle with DNA samples from the CEPH panel, a HLA type screen at high throughput level with randomly selected DNA samples from the registries was successfully performed.

Die Transplantation von allogenetischen Stammzellen ist eine sehr effektive Behandlung einer Vielzahl von hämatologischen Erkrankungen, wie malignanten Erkrankungen (z.B. akute und chronische Leukämie, Myelodysplasia), aplastische Anämie, Immundefekten und vererbliche metabolische Störungen. Dabei sind Transplantate von HLA-identischen Spendern aus der Familie (z.B. HLA- identische Geschwister) am besten geeignet. Jedoch ist in den häufigsten Fällen kein geeigneter Spender in der Familie vorhanden. In diesen Fällen muss ein passendes Transplantat bei freiwilligen Spendern, die nicht mit dem Patienten verwand sind, gefunden werden. In den letzten Jahren wurden immer öfter die Stammzellen aus dem Blut gewonnen, insbesondere aus dem Blut der Nabelschnur. Doch die häufigste Quelle ist noch immer das Knochenmark. Das größte Problem ist das Finden eines geeigneten Spenders. Die Schwierigkeiten werden hierbei hauptsächlich durch die große genetische Vielfältigkeit des MHC (MHC = Major Histocompatibility Complex) und seine variable Verteilung über die Populationen hervorgerufen. Die Moleküle des menschlichen MHCs werden auch HLA-Moleküle (HLA = Human Leukocyte Antigens) genannt. Zur Abdeckung des Bedarfs an Transplantaten wird eine große Menge an potentiellen freiwilligen Knochenmark-Spendern benötigt. Heutzutage sind mehr als acht Millionen Spender weltweit registriert, davon mehr als zwei Drittel in den 24 europäischen Registraturen. Die Verbesserung der Effektivität der Registraturen um die Wahrscheinlichkeit einen geeigneten Spender unter akzeptablen ökonomischen Konditionen zu finden, ist ein permanentes Ziel. Zu diesem Zweck wurde im Jahre 2001 ein von der EU finanziertes Projekt begonnen. Das Projekt hatte zum Ziel eine neue Strategie zu entwickeln, welche es erlaubt die Effektivität der Registraturen zu verbessern bei gleichzeitiger Senkung der Kosten. Ein Teil dieser neuen Strategie ist es die potentiellen Spender auf ihre HLA-Typen zu untersuchen. Hierzu wurden die bekannten Allele der transplantations- relevanten HLA-Gene, HLA-A, -B und -DRB1, in zwei Gruppen eingeteilt, frequente Allele und seltene Allele. Als frequente Allele wurden jene definiert, welche die 15 häufigsten HLA-Haplotypen bilden, die in den am Projekt beteiligten Registraturen vorkommen. Nur die Spender mit einem seltenen HLA-Typ sind für die Registraturen von besonderem Interesse und sollen einer hochauflösenden Typisierung unterzogen werden. Für die Untersuchung der Spender-DNA ist eine robuste, zuverlässige und einfach zu verwendende Methode für den Hochdurchsatz erforderlich. Mit der hier vorgelegten Arbeit wurde eine auf der DNA-Analyse basierende Methode entwickelt, die eine Bestimmung der HLA- Typen im Hochdurchsatz erlaubt. Die Identifizierung der HLA- Typen basierte bei dieser Methode auf die Genotypisierung von Mikrohaplotypen. Mikrohaplotypen sind in diesem Fall kurze DNA Sequenzen von 4 5 Basen Länge. Der Informationsgehalt von Mikrohaplotypen ist signifikant höher als die Summe der Informationsgehalte der separaten Einzelbasenpolymorphismen (SNP = Single Base Polymorphisms) aus denen die Mikrohaplotypen bestehen. Für die Identifikation von frequenten und seltenen Allelen wurde ein Satz von Mikrohaplotypen-Marker ausgewählt, die eine mittlere bis hohe Auflösung in der Identifikation der HLA-Typen erlaubt. Für die Genotypisierung der Mikrohaplotypen wurde der GOOD Assay gewählt. Der GOOD Assay ist eine SNP- Genotypisierungsmethode mit massenspektrometrischer Detektion und hohem Automationsgrad. Im Rahmen der Arbeit wurden neue Software-Programme entwickelt, die für die Selektion der Mikrohaplotypen- Marker und der vollautomatischen Daten-Analyse notwendig sind. Diese Programme erlauben hohe Flexibilität für den Einsatz der neuen Methode für weitere hochpolymorphe Regionen im Genom (z.B. HLA-C). Abschließend wurde mit der Methode im Rahmen des Projektes ein HLA Typen Scann im Hochdurchsatz erfolgreich angewendet.