Effect of dietary Enterococcus faecium NCIMB 10415 and zinc oxide on porcine influenza virus infection in vitro and in vivo

Abstract

Swine influenza virus (SIV) causes severe suffering at the animal level and significant economic losses in the swine industry worldwide. Since epithelial cells in pig trachea contain both human and avian type receptors (α 2, 6- and α 2, 3-linked sialic acid, respectively), pigs are supposed to be the “mixing vessels” for a wide range of influenza A viruses and as the potential source for new human-avian influenza A virus reassortants. Therefore the control of swine influenza viruses plays an important role both from the animal health and from the public health point of view. To address this question, two studies were performed in porcine model - In vitro and in vivo. Concerning the in vitro study, we assessed the inhibitory potential of the probiotic Enterococcus faecium NCIMB10415 on the replication of two porcine strains of influenza virus (H1N1 and H3N2 strain) in a continuous porcine macrophage cell line (3D4/21) derived from lung macrophages and in the continuous epithelial cell line, MDBK cells. Cell cultures were treated with E. faecium at the non- toxic concentration of 1x106 CFU/ml in growth medium for up to 90 min before, during and after SIV infection. After further incubation of cultures in probiotic-free growth medium, cell viability and virus propagation were determined at 48 h or 96 h post infection in 3d4/21 and MDBK cells, respectively. The results obtained reveal an almost complete recovery of viability of SIV infected cells and an inhibition of virus multiplication by up to four log units in the E. faecium treated cells. In both 3D4- and MDBK- cells a 60 min treatment with E. faecium stimulated NO release which is in line with published evidence for an antiviral function of NO. Furthermore, E. faecium caused a modified cellular expression of selected mediators of defense in 3D4-cells: while the expression of TNF-α, TLR-3 and IL-6 were decreased in the SIV-infected and probiotic treated cells, Il-10 was found to be increased. Since we obtained experimental evidence for the direct adsorptive trapping of SIV through E. faecium, at the cellular level, this probiotic microorganism inhibits influenza viruses by at least two mechanisms, direct physical interaction and strengthening of innate defense. Concerning the in vivo study, we tested if probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 or zinc (Zn) oxide as feed supplements could provide beneficial effects on SIV vaccination and infection in piglets. Seventy-two weaned piglets were fed three different diets containing either E. faecium or high (2,500 ppm) or normal levels of Zn oxide (natural Zinc content: 50-80 ppm, control). Half of the piglets were vaccinated intramuscularly (VAC) twice with an inactivated trivalent SIV vaccine. All piglets were then infected intranasally with H3N2 SIV. Clinically, significantly higher weekly weight gains were observed in the E. faecium group before virus infection, and piglets in Zn and E. faecium groups gained weight, while those in the control group lost weight. Using ELISA, we found significantly higher H3N2-specific antibody levels in the E. faecium+VAC group 2 days before and at the day of challenge infection as well as at 4 and 6 days after challenge infection. Higher hemagglutination inhibition (HI) titers were also observed in the Zn+VAC and E. faecium+VAC groups at 0, 1 and 4 days after infection. However, there were no significant differences in virus shedding and lung lesions between the dietary groups. Compared to the control group, significantly higher CD4+CD8+ and CD8+ (cytotoxic T lymphocytes, CTL) were detected in the Zn and E. faecium groups at various time points after infection as determined by flow cytometry. Our results suggest that feeding high doses of zinc oxide and particularly E. faecium could beneficially influence humoral immune responses after vaccination and recovery from SIV infection, but not affect virus shedding and lung pathology.

Schweineinfluenzaviren (SIV) verursachen bei Tieren erhebliches Leiden und gravierende Verluste in der weltweiten Schweineproduktion. Weil die Epithelzellen in der Trachea des Schweins sowohl den Humantyp als auch den aviären Typ des Rezeptors (α 2, 6- und α 2, 3-verknüpfte Neuraminsäure) enthalten, werden Schweine als die Mischbatterien für ein weites Spektrum unterschiedlicher Influenza A Viren betrachtet und damit als die potenzielle Quelle neuer human- und vogelgängiger neuer Reassortanten. Deshalb spielt die Kontrolle der Schweineinfluenzaviren im Hinblick auf die Tiergesundheit und ebenso auf das öffentliche Gesundheitswesen eine wichtige Rolle. Um einen Beitrag zu liefern, der beiden Gesichtspunkten Rechnung trägt, wurden unter Verwendung eines porcinen Modellsystems zwei Studien zur Kontrolle von Schweineinfluenzaviren unternommen – in vitro und in vivo. Das in vitro- Experiment betreffend wurde untersucht, ob das Probiotikum Enterococcus faecium NCIMB10415 Potenzial zur Vermehrungshemmung von zwei porcinen Influenza virus Stämmen (H1N1 and H3N2) besitzt. Als Wirtssysteme wurden eine aus Lungenmakrophagen abgeleitete, kontinuierliche porcine Makrophagenzelllinie (3D4/21) sowie eine kontinuierliche Epithelzelllinie, MDBK-Zellen, verwendet. Die Zellkulturen wurden für bis zu 90 Minuten vor, während oder nach der Infektion mit SIV einer nicht-toxischen Konzentration von 1x106 CFU/ml E. faecium im Wachstumsmedium ausgesetzt. Nach einer weiteren Inkubation der Zellen in Wachstumsmedium ohne Probiotikum wurden nach 48 (3d421/) bzw. 96 Stunden (MDBK-Zellen) die Viabilität der Zellen wie auch die bis dahin erfolgte Virusvermehrung bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse offenbarten eine annähernd normale Viabilität der mit E. faecium behandelten SIV-infizierten Zellen und damit einen wirksamen Schutz der Zellen vor der SIV-Infektion. Die Virustitrationen ergaben, dass die Virusvermehrung in den mit E. faecium behandelten Zellen um bis zu vier Log-Stufen reduziert war. Eine 60-minütige Behandlung mit E. faecium führte sowohl in 3D4- als auch in den MDBK-Zellen zur Stimulation der NO-Sekretion, was mit Literaturdaten in Einklang steht. Zudem verursachte E. faecium insbesondere in 3d4-Zellen eine Veränderung der zellulären Expression ausgewählter Mediatoren der zellulären Abwehr. Während die Expression von TNF-α, TLR-3 und IL-6 in SIV-infizierten und Probiotika-behandelten Zellen reduziert waren, konnte für IL-10 eine gesteigerte Expression beobachtet werden. Die Ergebnisse von Adsorptionsexperimente zeigten, dass E. faecium in der Lage ist, SIV zu adsorbieren. Die erzielten in vitro Ergebnisse zeigen, dass die untersuchten probiotischen Mikroorganismen Influenzaviren auf zellulärer Ebene über mindestens zwei Mechanismen hemmen können, die direkte physikalische Interaktion (Adsorption) und mittels Stärkung der natürlichen Immunität. Mit Hilfe der in vivo-Studien sollte geprüft werden, ob das Probiotikum Enterococcus faecium NCIMB 10415 sowie Zinkoxid (ZnO) als Futterzusätze geeignet sind, die SIV-Impfung von Ferkeln und damit die Infektion der Tiere mit SIV positiv zu beeinflussen. Hierzu erhielten 72 Absatzferkel Futter, dem entweder E. faecium oder eine hohe Dosis ZnO (2,500 ppm) beigemischt war, oder das als Kontrolle kein weiteres ZnO enthielt (natürlicher Zinkgehalt 50-80 ppm). Die Hälfte der Tiere in jeder der Fütterungsgruppen wurde zweifach mit einem inaktivierten, trivalenten SIV-Impfstoff intramuskulär geimpft (VAC). Anschließend wurden alle Tiere intranasal mit H3N2 SIV infiziert. Vor der SIV- Infektion wurde in den mit E faecium-Zusatz gefütterten Tieren eine gesteigerte wöchentliche Gewichtszunahme beobachtet. Nach der SIV-Infektion nahm das Gewicht in den mit der hohen Zink-Dosis und E. faecium supplementierten Ferkeln zu während die Tiere, die das Kontrollfutter erhielten, an Gewicht verloren. Mit Hilfe der ELISA-Technik wurden in der E. faecium+VAC-Gruppe signifikant erhöhte Konzentrationen von H3N2-spezifischen Antikörpern zwei Tage vor sowie am Tag der Challenge-Infektion und 4 und 6 Tage nach der Infektion nachgewiesen. Erhöhte Hämagglutinations- Inhibitionstiter (HI) wurden ebenfalls in the Zn+VAC sowie der E. faecium+VAC Gruppe an den Tagen 0, 1 and 4 nach der Infektion bestimmt. Allerdings waren zwischen den Fütterungsgruppen keine signifikanten Unterschiede in der Virusproduktion nachzuweisen. Verglichen mit der Kontrollgruppe fanden sich in der hoch dosierten Zn- sowie der E. faecium-Fütterungsgruppe zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion bei der durchflußzytometrischen Analyse des Blutes signifikant erhöhte Mengen an CD4+CD8+ und CD8+ (zytotoxische T Lymphozyten, CTL). Zusammen genommen legen die erzielten Ergebnisse den Schluss nahe, dass die Zufütterung hoher Konzentrationen von Zinkoxid und besonders die Supplementierung mit E. faecium durch Steigerung der humoralen Abwehr die Überwindung der SIV-Infektion geimpfter Tiere positiv beeinflussen kann. Allerdings wurden keine Hinweise auf eine fütterungsbedingte Hemmung der Virusausscheidung und der Pathologie der Lunge verzeichnet.