The identification of novel antivirals and enhancers of influenza virus replication via high-throughput screening of small molecular weight compounds

Abstract

Every year, influenza viruses cause up to 5 million cases of severe illness and up to 500,000 deaths worldwide. The spread of highly pathogenic avian influenza across several continents and the emergence of a highly transmissible pandemic H1N1 strain in 2009 underline the urgent need for novel antivirals and innovations in vaccine production. Currently, there are only four FDA-approved drugs available for the treatment and prevention of influenza: the M2 ion channel inhibitors (adamantanes), amantadine and rimantadine, and the neuraminidase inhibitors, oseltamivir and zanamivir. Unfortunately, the emergence of resistant influenza virus strains has precluded the use of adamantanes for the past influenza seasons. Vaccines have been efficient in preventing illness, but they are not accessible for a greater part due to the increasing demand which is often beyond manufactures capacities. We have developed a cell-based high throughput screen assay for the identification of compounds that modulate influenza virus replication either negatively or positively. For this purpose, we designed a luciferase reporter gene that is expressed in human lung epithelial (A549) cells and mimics a viral RNA segment (vRNA) after being transcribed. Infection of these cells with the influenza A/WSN/33 (H1N1) virus provides the viral polymerase to initiate the production of luciferase which is measured as an indication of viral replication. Potential inhibitors can therefore be identified as they suppress luciferase signals. In contrast, an increase in luminescence indicates enhanced viral polymerase activity and therefore leads to the identification of compounds that boost viral replication. Such compounds could be beneficial for use in the production of tissue culture-grown vaccines. The antiviral high throughput screen assay was optimized in a 96-well format and its validity confirmed by exhibiting z’ factors of ~ 0.79. Adaptation to a 384-well format allowes screening of standardized compound libraries. We screened approximately 73,000 compounds at the Institute of Chemistry and Cell Biology (ICCB) at Harvard Medical School. Screening known bioactive compounds, we identified distinct groups of inhibitors and enhancers which act directly on cellular sodium channels and regulate intracellular sodium concentrations or affect protein kinase C (PKC). Inhibition of epithelial sodium channels or activation of PKC leads to enhanced virus production. In direct contrast, a sodium channel opener, a sodium ionophore and Na+/K+-ATPase inhibitors, as well as PKC inhibitors significantly reduce viral replication. Future work will reveal the role of intracellular sodium concentration and molecular mechanism behind these effects. Among compounds with unknown biological properties, we identified 18 that exhibit anti-influenza virus activity at non-cytotoxic concentrations. Through the use of influenza virus-like particle (VLP) and pseudotyped particle (PP) entry assays we could show that one compound, namely C2, targets the entry step of influenza virus infection. As a recently described vATPase inhibitor, C2 has broad antiviral activity against various viruses that enter via receptor mediated endocytosis and require a low pH during entry. Currently, in vivo studies in mice are performed to determine whether C2 can be utilized for the treatment of viral infections. Employing influenza virus mini-genome assays and primer extension assays, we identified two compounds (A3 and A35) that target the influenza virus polymerase function. Interestingly, compound A3 shows in vitro increased potency over ribavirin, a broadband antiviral. Furthermore, A3 inhibits the replication of both influenza A and B viruses as well as of RNA viruses of different families such as vesicular stomatitis virus (VSV) and Sindbis virus (SINV). Future studies will reveal A3’s mode of action and its in vivo capacity as a broadband antiviral. Compound A35 potently inhibits viral replication in vitro prior and post infection. It is specific for the influenza A/WSN/33 virus and inhibits the interaction of the viral polymerase complex with the nucleoprotein (NP) as demonstrated by Co-immunoprecipitation. Further studies are needed to determine whether A35 blocks replication and/or transcription of the viral genome. An identified putative compound binding site in NP needs to be confirmed in binding assays or by co-crystallization. In summary, we found that the intracellular sodium concentration and PKC activity can affect viral replication in a positive or negative manner. In addition, three novel lead compounds were identified that target either viral entry or the influenza virus replication complex. Two compounds exhibit broadband antiviral activity and one targets the viral NP protein – a novel influenza antiviral target.

Die Zahl schwerer Atemwegserkrankungen hervorgerufen durch das Influenza Virus liegt jaehrlich bei 3-5 Millionen and verursacht bis zu 500,000 Todesfaelle weltweit. Der Ausbruch und die Verbreitung hoch pathogenen Vogelgrippe-Viren in Verbindung mit dem Auftauchen eines neuen hoch ansteckenden Pandemievirus’ im Jahre 2009, unterstreichen die dringende Notwendigkeit fuer neue antivirale Medikamente, sowie Innovationen in der Impfstoffproduktion. Derzeit gibt es in den USA lediglich vier staatlich zugelassene Medikamente zur Behandlung und Vorbeugung von Influenza. Adamantan-derivate wie Amantadine (Symmetrel®) und Rimantadine (Flumadine®) blocken den viralen M2 Ionenkanal and Oseltamivir (Tamiflu®) and Zanamivir (Relenza®) inhibieren die virale Neuraminidase. Das Auftauchen resistenter Viren gegen beide Wirkstoffklassen und die weite Verbreitung solcher hat den Gebrauch von Adamantanen in den letzten Jahren eingeschraenkt. Grippeschutzimpfungen beugen effizient der Verbreitung von Influenza Viren vor, sind aber nicht immer zugaenglich fuer die breite Bevoelkerung aufgrund stetig steigender Nachfrage oder Produktionsengpaessen. Wir entwickelten einen zellkultur-basierten High-Throughput Screen Assay, der Wirkstoffe identifizieren kann, die die virale Replikation negativ oder auch positiv beinflussen koennen. Fuer diese Assay wurde ein Luziferase-Reportergen konstruiert, welches einem viralen RNA (vRNA) Segment gleicht, wenn in humanen lungepithelialen (A549) Zellen exprimiert. Waehrend einer Infektion dieser Zellen, wenn die virale Polymerase zahlreich vorhanden ist, wird Luziferase produziert, deren Aktivitaet einen quantitativen Indikator fuer virale Replikation darstellt. Wirkstoffe werden als potentielle Inhibitoren klassifiziert, wenn sie das Luziferasesignal vermindern, wohingegen ein erhoehtes Signal auf verstaerkte virale Replikation hindeutet und somit ein “Enhancer-Molekuel” identifizieren kann. Molekuele solcher Art koennten sich als hilfreich heraustellen, fuer die Produktion von Impfstoffen in Zellkultur. Nach der Optimierung des High-Throughput Screen Assays in 96-well Zellkultur- Platten wurde dessen Qualitaet verifiziert mit einem z’ factor von ~0.79. Im Institut fuer Chemie und Zellbiologie der Harvard Medical School wurde der Assay auf das 384-well Plattenformat adaptiert und Bibliotheken mit ungefaehr 73,000 Molekulen systematisch getestet. Unter den Molekuelen mit bekannten bioaktiven Eigenschaften, identifizierten wir zwei Klassen von Inhibitoren und Enhancern, die einen direkten Einfluss auf zellulaere Natriumkanaele und die innerzellulaere Natriumkonzentration ausueben oder auf die Protein Kinase C (PKC). Die Inhibition von epithelialen Natriumkanaelen (ENaCs) und die Aktivierung von PKC fuehren zu einer erhoehten Virusproduktion in vitro. Dementsprechend verringern die Oeffnung von ENaCs, Natriumionophore, Inhibierung von Na+/K+-ATPasen, sowie die Inhibition von PKC, die virale Replikation deutlich. Zukuenftige Arbeit wird zeigen, welche Rolle die intrazellulaere Natriumkonzentration im viralen Replikationszyklus spielt. Der Grossteil der getesteten Molekuele besitzt ad dato keine bekannten bioaktive Eigenschaften. Unter diesen wurden 18 identifiziert, die antivirale Wirkung, spezifisch gegen das Influenza Virus aufweisen, ohne dabei Zelltoxizitaet hervorzurufen. Unter der Zuhilfenahme von Influenza Virus-like particle (VLP) und pseudotyped particle (PP) Entry Assays konnten wir fuer das Molekuel C2 zeigen, dass es das Eindringen von Influenza Viren in die Zelle blockt. Kuerzlich wurde C2 als ein Inhibitor von zellulaeren vATPases beschrieben; wir konnten zeigen, dass diverse Viren, die mittels rezeptor-vermittelter Endozytose und niedrigem pH Wert in die Zelle gelangen, von C2 inhibiert werden. Inwieweit C2 genutzt werden kann fuer die Behandlung von Infektionen dieser Art Viren, wird derzeit in in vivo Studien getestet. In Influenza Virus Mini-Genome Assays and Primer Extension Assays wurden 2 Molekuele (A3 und A35) entdeckt, die die Funktion der viralen Polymerase inhibieren. A3 weist erhoehte in vitro Wirksamkeit auf verglichen zu Ribavirin, einem Breitband antiviralem Medikament. Interessanterweise inhibiert A3 nicht nur alle bislang getesteten Influenza A Viren, sondern auch das Influenza B Virus und andere RNA Viren unterschiedlicher Familien, wie zum Beispiel, das Vesicular- Stomatitis-Virus und das Sindbis Virus. Weiterfuehrende Arbeit wird zeigen, welchem Mechanismus die Inhibition durch A3 zugrunde liegt und ob sich die Breitband antivirale Wirkung in vivo bestaetigen laesst. Das Molekuel A35 ist ein starker viraler Inhibitor, selbst spaet im Replikationszyklus. Es ist spezifisch fuer das Influenza A/WSN/33 (H1N1) Virus und inhibiert die Interaktion zwischen dem viralen Polymerasekomplex und dem Nucleoprotein (NP), gezeigt mittles Co-immunoprezipitation. Zukuenftige Arbeit mit A35 sollte zeigen, ob durch die Inhibition der viralen Polymerase die Replikation und/oder die Transkription blockiert wird. Die in dieser Studie identifizierte Bindungsstelle von A35 in NP wird in Zukunft in speziellen Bindungsassays oder mittels Co-Kristallisation bestaetigt werden. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit gezeigt, dass die intrazellulaere Natriumkonzentration und die Aktivitaet der PKC die virale Replikation positiv und negativ beeinflussen kann. Es wurden drei Molekule identifiziert, die den viralen Eintritt in die Zelle oder den viralen Replikationskomplex inhibieren. Zwei dieser Molekuele weisen Breitband antivirale Wirkung auf, und eines, inhibiert das virale Nukleoprotein, welches bislang noch nicht als Target antiviraler Wirkstoffe beschrieben wurde.