Die immunstimulatorische Wirkung von Cyanacrylate Skin Surface Stripping auf die Aktivierung und Migration von Langerhanszellen der menschlichen Haut in vitro und in vivo

Abstract

Transkutane Vakzinierung ist eine viel versprechende Alternative zur konventionellen Impfstoffapplikation mittels Injektion, da u.a. die Haut verglichen mit Muskel- und Fettgewebe besonders reich an Antigen- präsentierenden Zellen (APC) und insbesondere an Langerhanszellen (LC) ist. Verschiedene Techniken zur Überwindung der Hautbarriere wurden bereits vorgeschlagen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass ein neu entwickeltes Protokoll basierend auf Cyanacrylate Skin Surface Stripping (CSSS), welches die Penetration über den HF erleichtert, sicher ist und darüber hinaus effektiv zelluläre Immunantworten induziert. Dies geschieht möglicherweise über Haarfollikel (HF)-assoziierte LC. Postulierte Wirkmechanismen von CSSS sind sowohl die partielle Überwindung der Hautbarriere als auch mögliche immunstimulatorische Effekte. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Auswirkung von CSSS auf Dichte und Morphologie, das Verteilungsmuster sowie den Aktivierungszustand von LC der menschlichen Haut in vitro und in vivo. Die Untersuchungen wurden teils an exzidierter Haut, teils in vivo an gesunden Probanden durchgeführt. Mittels Untersuchung des Expressionsverhaltens von Oberflächen-Antigenen wurde erstmalig die Wirkung von einem bzw. zwei CSSS auf LC u.a. im Vergleich zu topisch appliziertem TNF-α über einen Zeitverlauf von 32 Stunden dokumentiert (n=6). Die Expression der Oberflächenantigene CD1a (spezifisch für LC), CD83, CD86 (beides Aktivierungsmarker von APC) und HLA-DR wurde nach Immunfluoreszenzfärbung sowohl in Epidermisplättchen als auch in Kryo-Hautquerschnitten dokumentiert und auf ihre Morphologie hin ausgewertet. Zur Validierung und als Referenz zu den in exzidierter Brusthaut ermittelten Ergebnissen bezüglich Dichte und Morphologie der LC wurden zusätzlich in vivo erzeugte Saugblasen- Epidermisplättchen des Unterarms untersucht (n=8). Aus den Immunfluoreszenzuntersuchungen ergeben sich folgende Aussagen: In vivo in Unterarmepidermis zeigte sich eine annähernd identische Dichte an CD1a+ Zellen wie in exzidierter Brusthaut (508 bzw. 550/mm2), welche in vivo bis 6 Stunden nach einem CSSS weitestgehend konstant blieb. In Kryoschnitten fanden sich CD1a+ Zellen vergleichbar häufig in der Epidermis und im HF-Infundibulum (13,85/mm bzw. 8,42/mm). 24 Stunden nach zwei CSSS war die Abnahme der CD1a+ Zellen in der Epidermis mit ca. 47% verglichen zum Zeitpunkt 0 Stunden stärker als nach einem CSSS oder nach TNF-α-Applikation; im HF-Infundibulum fiel die Abnahme geringer aus. Die deutliche Abnahme von LC ist möglicherweise das Ergebnis von LC-Migration, induziert durch die zellaktivierende Wirkung von CSSS. Während die Anzahl HF-assoziierte LC geringer ausfiel als die epidermaler LC, zeigten die LC im HF-Infundibulum interessanterweise morphologisch ein wesentlich stärker ausgeprägtes Dendritengeflecht, welches hier erstmalig beschrieben wird. 24 Stunden nach CSSS ließ sich eine Zunahme morphologisch aktiviert erscheinender CD1a+ Zellen dokumentieren, dabei erzielten CSSS und topisch appliziertes TNF-α eine ähnlich starke Wirkung. Der Anteil morphologisch aktiviert erscheinender Zellen wurde am stärksten durch topische Applikation von TNF-α auf 32% nach 24 Stunden Inkubation gesteigert. 24 Stunden nach CSSS bzw. TNF-α-Applikation zeigten sich CD1a+, HLA-DR+, CD83+ sowie CD86+ Zellen mit deutlichen morphologischen Aktivierungszeichen. HLA-DR+ Zellen waren unter Kontrollbedingungen vergleichbar häufig wie CD1a+ Zellen. Die Abnahme nach zwei CSSS fiel mit ca. 22% deutlich geringer aus als bei CD1a+ Zellen. CD83+ und HLA-DR+ Zellen korrelierten unter den verschiedenen Behandlungen in ihrem Expressionsverhalten, wobei im Durchschnitt etwa ¼ weniger CD83+ Zellen als HLA-DR+-Zellen zu finden waren. CD86 wurde nach CSSS und TNF-α-Applikation vergleichbar hoch reguliert, während CD1a in seiner Expression deutlich abnahm. Somit konnten für CD83 und CD86 unterschiedliche Expressionsmuster festgestellt werden, die für eine differenzierte Expression bei Zellaktivierung sprechen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit mittels der CSSS-Abrisse, die Dichte der HF an Brusthaut (n=5) und Unterarmhaut (n=6) dokumentiert. Dabei wurde die Wirkung von einem und zwei CSSS auf die Mitnahme des Haarschaftes verglichen. An der Unterarminnenseite fanden sich viermal mehr HF als auf exzidierter Brusthaut (30,42 bzw. 7,25 HF/cm²). Dabei zeigte sich, dass die überwiegende Mehrheit der HF-Strukturen nach CSSS-Anwendungen intakt bleibt (in vivo 78,07%; ex vivo 62,07%). Die über CSSS-Abrisse ermittelte Haarfollikeldichte ließ sich mit der digitalen Trichoscan®-Fotografie validieren: beide Herangehensweisen führten zu nahezu deckungsgleichen Ergebnissen. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse erstmalig die Schlussfolgerung zu, dass CSSS eine eindeutig immunstimulatorische Wirkung auf LC besitzt. Des Weiteren bestätigen die Ergebnisse, dass Hautexzidate des Menschen als innovatives in vitro-Modell dienen können. Es konnte gezeigt werden, dass diese nicht nur zu Penetrationseigenschaften topisch applizierter Stoffe, sondern auch zu Zellfunktionen höchst relevante Aussagen liefern. CSSS, das nicht invasiv ist und vom Menschen gut toleriert wird, ist dank seiner zweifachen Wirkung als mechanisches immunstimulatorisches Adjuvans und als Penetrationsförderer, somit ein viel versprechendes Werkzeug für die Erarbeitung transkutaner Vakzinierungsmethoden.

Transcutanous immunization (TCI) is a promising alternative to conventional injections, because in contrast to muscle and fat tissue, the skin is especially rich in antigen-presenting cells, e.g. Langerhans cells (LC). Different techniques have been proposed to overcome the barrier function of the skin. Recently, a newly developed protocol based on cyanoacrylate skin surface stripping (CSSS), which facilitates penetration via hair follicles, has been shown to be safe and effective in inducing cellular immune responses, possibly via targeting of hair follicle-associated LC. Barrier disruption as well as possible immunostimulatory effects caused by CSSS were postulated key factors. In order to assess the effects of CSSS on the distribution and the activation of LC in human skin, we investigated the expression of CD1a (specific for LC), CD83 and CD86 (known as activation markers) and HLA-DR by immunofluorescence on epidermal sheets and on cryosections prepared from excised human skin obtained from six patients undergoing plastic surgery. Changes of morphology, density and expression of activation markers in response to one CSSS, two CSSS procedures or topical application of TNF-alpha were studied, respectively. LC morphology and density were compared to epidermal sheets obtained by suction blister induction in eight healthy human volunteers. With 508 cells/mm2 in suction blister epidermis compared to 550 cells/mm2 in excised breast skin, LC density was similar in vivo and in vitro. Analysis of the cryosections revealed that LC dendricity, but not density was greater in hair follicle-associated LC (8,42 cells/mm) compared to LC in the interfollicular epidermis (13,85 cells/mm). 24hrs after CSSS, distinct retraction of dendrites and rounding of the cell body of CD1a+ cells and a higher expression of HLA-DR, CD83 and CD86, was found in both CSSS- and TNF- alpha-treated samples. A marked decrease of LC was observed, which was most prominent 24 hrs after 2 CSSS procedures (288,5/mm2) and which was most likely a result of LC migration in response to CSSS-induced activation. In conclusion, this study provides strong evidence, that treatment of skin with CSSS exerts immunostimulatory effects. Our studies further confirm that human skin explants are a valuable in vitro model and yield highly relevant preclinical data not only on penetration properties of topically applied compounds, but also on cell function. Due to its combination of immunostimulation and facilitated penetration, CSSS, which is non-invasive and well tolerated in humans, is a highly promising new approach in transcutaneous vaccination.