Untersuchungen zum Gentransfer in die Lunge mittels nicht-viraler Pulveraerosole und viraler Vektoren basierend auf dem Adeno-assoziierten Virus (AAV) 2/9

Abstract

In dieser Arbeit wurden zwei Themengebiete des pulmonalen Gentransfers behandelt. Im ersten Teil wurde ein Pulveraerosol für den nicht-viralen Gentransfer mit PEI/pDNA-Komplexen entwickelt. Im zweiten Teil wurde ein AAV2/9-Vektor zum lokalen viralen Gentransfer in die Lunge untersucht. Die Entwicklung des Pulveraerosols hat den Hintergrund, dass die Applikation nicht-viraler Genvektoren in Form von wässrigen Aerosol-Formulierungen große Stabilitätsprobleme mit sich bringt, die mit der Entwicklung eines Pulveraerosols behoben werden können. Dies ist von besonderer Bedeutung bei der Verwendung von Aerosol-Formulierung in klinischen Studien, da diese zum aktuellen Zeitpunkt stets unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden müssen. Dies ist angesichts der gewünschten GMP-Bedingungen problematisch. Die Herstellung der Pulveraerosole erfolgte durch Lyophilisation von PEI/ pDNA- Komplexen zusammen mit Disacchariden (Lactose, Trehalose und Saccharose) und anschließende Zerkleinerung im CapMix. Die Untersuchung verschiedener Disaccharide als Lyoprotektoren ergab keine Unterschiede bezüglich der biophysikalischen Eigenschaften der resultierenden Formulierungen. Die Partikelgröße nahm zu, sobald die Lyophilisation nicht mit mindestens 250-fachem Disaccharidüberschuss durchgeführt wurde. Im Weiteren kam es nach Pulverisierung zu einer Partikelgrößenzunahme unabhängig von der zugesetzten Disaccharidmenge; einzig Formulierungen mit einem 50-fachen Disaccharidüberschuss resultierten in kleineren Komplexen. Nach der Lyophilisation kam es unabhängig von der zugesetzten Disaccharidmenge zu einem Anstieg des Zetapotenzials, das auch nach Pulverisierung noch erhöht war. Die Freisetzung der pDNA aus den lyophilisierten Komplexen mittels Inkubation mit Heparansulfat und anschießender Gelelektrophorese erfolgte komplett. Nach der Pulverisierung wurde die pDNA ebenfalls aus den Komplexen freigesetzt, allerdings konnte bei den Proben mit einem 50-fachen Disaccharidüberschuss nur ein Teil der pDNA freigesetzt werden. Die Charakterisierung der Pulveraerosole am Andersen Kaskadenimpaktor zeigte erste Unterschiede zwischen den eingesetzten Disacchariden. Der ermittelte MMAD war für Saccharose mit 4,3 µm am kleinsten, womit Saccharose das feinste Pulveraerosol lieferte. Mit Lactose resultierte eine MMAD von 4,7 µm und mit Trehalose einer von 5 µm. Die in vitro Untersuchungen wurden auf zwei verschiedenen Bronchialepithel-Zelllinien durchgeführt. Es konnte wie auch bei den biophysikalischen Untersuchungen kein Unterschied zwischen den Disacchariden festgestellt werden. Tendenziell kam es nach Lyophilisation zu einer leicht verbesserten Genexpression bei allen eingesetzten Disaccharidüberschüssen im Vergleich zur Kontrolle. Nach der Pulverisierung war die Genexpression vergleichbar mit derjenigen der Kontrollkomplexe, wenn mindestens ein 100-facher Disaccharidüberschuss eingesetzt wurde. Formulierungen mit einem 50-fachen Überschuss resultierten nach Pulverisierung in einer tendenziell schlechteren Expression. Die in vivo Versuche mit Luciferase zeigten die Genexpression in den Lungen der Mäuse. Nach Quantifizierung der Luciferase-Expression bezogen auf das Lungengewebe konnte für Lactose als Lyoprotektor die höchste Genexpression gezeigt werden. Die Bestimmung der in der Lunge aufgenommenen pDNA mittels Real-Time PCR resultierte in signifikant höheren Werten in der Lactose-Gruppe im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen. Die Verwendung eines für Erythropoetin kodierenden Plasmids in Form des Lactose-Pulvers resultierte in einer signifikanten Erhöhung des Hämatokritwertes. Histologische Untersuchungen der Lungen zeigten eine geringgradige Entzündung, die mit der Einwanderung von Erythrozyten und neutrophilen Granulozyten einherging. Dies konnte sowohl nach Applikation der PEI/pDNA-Pulveraerosols aus auch nach der Verneblung von reinem Lactosepulver beobachtet werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass durch Verwendung geeigneter Lyoprotektoren die Formulierung von Pulveraerosolen mit PEI/pDNA-Komplexen möglich ist und die in vivo Applikation zu einem physiologischen Effekt führt. Damit stellt diese Applikationsform eine vielversprechende Option für den pulmonalen Gentransfer dar. Die Verwendung nicht-viraler Vektoren führt nur zu einer transienten Expression des Transgens, weshalb im zweiten Abschnitt dieser Arbeit ein viraler AAV2/9-Vektor für den pulmonalen Gentransfer untersucht wurde. Unter den viralen Vektoren bieten AAV-Vektoren verschiedene Vorteile. Der Wildtypvirus ist beim Menschen nicht pathogen, es besteht keine Gefahr der insertionellen Mutagenese und die Immunantwort nach Applikation verläuft sehr mild. Im Vergleich zu dem bisher am häufigsten verwendeten AAV2-Vektoren sind sowohl die Prävalenz neutralisierender Antikörper als auch deren Titer für AAV2/9-Vektoren deutlich niedriger, weshalb diese eine attraktive Alternative darstellen. Nach Optimierung des Vektor Backbones, konnte in Balb/c-Mäusen gezeigt werden, dass die Applikationsroute keinen Einfluss auf die Transgenexpression hat. Sowohl nach intranasaler als auch nach intratrachealer Applikation blieb die Genexpression über 450 Tage konstant. Weiterhin hatte der Mausstamm keinen Einfluss auf die Genexpression. Dies konnte durch Versuche in konditionellen SPB-/--Mäusen gezeigt werden. Des Weiteren war die Genexpression unabhängig vom Geschlecht der Mäuse. Zwar war die Expression bei den weiblichen SPB-/--Mäusen zwischen 10- und 50-fach höher im Vergleich zu den männlichen Mäusen, die Unterschiede waren aber nicht signifikant. Die Applikation des AAV2/9 in die entzündete Lunge von SPB-/--Mäusen hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die Expression. Die Entwicklung neutralisierender Antikörper gegen den Vektor stellt die größte Hürde bei der wiederholten Applikation von AAV-Vektoren dar. Die Applikationsroute hatte keinen Einfluss auf diese Entwicklung. In beiden Gruppen waren 450 Tage nach Vektor-Applikation NAB nachzuweisen. Durch Dosisreduktion konnten zwar die NAB-Titer verringert werden, allerdings ging damit auch eine starke Verminderung der Transgenexpression einher. Weiterhin wurde die Entwicklung von NAB nicht durch das Geschlecht beeinflusst. Durch Immunsuppression mit Dexamethason konnten außerdem die Titer der NAB reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass es nach lokaler Applikation des AAV2/9-Vektors zur Transgenexpression in der gesamten Maus kommt. Die Verteilung des Vektors konnte durch Biodistributionsstudien belegt werden. Es zeigte sich die höchste Vektor-DNA Deposition in der Lunge. Die intratracheale Applikation lieferte eine höhere Vektor-DNA Konzentration in der Lunge kombiniert mit niedrigeren Mengen in Leber und Milz im Vergleich zur intranasalen Gruppe, allerdings waren die Unterschiede nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen, dass AAV2/9-Vektoren geeignet sind, um die Langzeit-Expression eines Transgens zu erreichen. Die Effizienz dieses Vektors in entzündeten Lungen lässt auf gute Ergebnisse in einem therapeutischen Modell hoffen. Bevor dieser Vektor allerdings klinisch eingesetzt werden kann, muss nach Methoden gesucht werden, die die Biodistribution nach lokaler Applikation verhindern und die Immunogenität reduzieren.

This work is divided into two parts, both regarding pulmonary gene delivery. The overall goal of the first part was the development of a powder aerosol for the delivery of PEI/pDNA complexes to the lung. The second part investigated the effect of gene expression, biodistribution and immuneresponse after pulmonary application of an AAV2/9 vector. The reason for developing a dry powder aerosol for pulmonary gene delivery is the well documented physical instability of aqueous suspensions of non-viral vector complexes over time. These instabilities include aggregation tendencies and loss of transfection efficiency, thus requiring fresh preparation each time directly prior to injection for maximal effect. Dry powder systems confer many advantages including increased stability, reduced drug loss during administration and improved portability. The technique of lyophilization was used to produce dry powder cakes followed by powderization with zirconia beads using a CapMix. Different sugars, namely lactose, sucrose and trehalose, were used as lyoprotectants. The first part of the study was directed at the biophysical characterization of complexes before and after lyophilization and after powderization. Particle size measurements of gene vector complexes showed that augmenting the amount of sugar, independent of the sugar type, used during lyophilization led to lower increase or maintenance of the particle size. Complexes lyophilized without sugar showed an enormous increase in particle size. After powderization, the particle size increased in nearly all samples. Only samples with a 50-fold excess of sucrose resulted in smaller particles in comparison to the size after lyophilization. In contrast to particle size, the increase of zeta potential is not influenced by the amount of sugar. DNA retardation assay revealed no major differences between freshly prepared, lyophilized and powderized complexes with exception of the powderized sample with an excess of 50/1 of sugar, which did not release pDNA completely. After characterizing the nanoparticles the resulting powders were analyzed by Andersen Cascade Impactor. Sucrose led to the finest powder with a MMAD of 4.3 µm, followed by Lactose (4.7 µm). The trehalose sample had a MMAD of 5 µm, thus producing the most coarse powder of all samples. These results show that although the sugars have no influence on the particle size of gene vector complexes, they do influence the MMAD of the powder aerosol. After biophysical characterization, complexes were used in transfection studies to explore their gene delivery potential in vitro. Lyophilized and powderized complexes were compared to freshly prepared complexes on BEAS-2B and 16HBE14o- cells. Lyophilization with different sugars did not lead to any difference in gene expression on both cell lines. Values measured with lyophilized samples were slightly higher than those of freshly prepared positive controls. Addition of free sugars, in amounts corresponding to concentrations presented on complexes, did not influence the transfection efficiency. After powderization process, gene delivery is retained in comparison to freshly prepared complexes. Only samples containing a 50-fold excess of sugar showed slightly decreased expression values. In vivo administration of powder aerosols resulted in gene expression in lungs of treated mice. Quantification of pDNA in lung tissue by real-time PCR resulted with lactose as lyoprotector during lyophilization in significantly, up to 3-fold higher values compared to the other two lyoprotectants. By using a plasmid coding for murine erythropoietin formulated with lactose a significant increase of the hematocrit value could be achieved, demonstrating a physiological response after powder aerosol treatment. Histological analysis of lungs treated with either PEI/pDNA lactose powder or lactose powder without gene vector complexes, showed a slide inflammation with increased numbers of erythrocytes and neutrophil granulocytes in the alveolar region. In summary, the first part of the work convincingly shows the applicability of dry powder aerosols for pulmonary gene delivery and expression of the desired transgene at physiological levels, making this technique a promising option for pulmonary gene delivery. Dominance of viral vectors in numerous gene therapy clinical trials can be attributed to their high efficiency of gene transfer. Desirable attributes like lack of pathogenicity, ability to transduce non-dividing cells, prolonged transgene expression and low immunogenicity present AAVs as potential vectors for clinical applications. The second part of this work successfully demonstrates stable long term expression using AAV2/9 based vector in two different mouse strains (BALB/c-mice and SPB-mice). After optimization of the vector backbone, no effect of either mouse genotype or pulmonary route of delivery on transgene expression could be observed. Gene expression was constant over 450 days both after intranasal and intratracheal application of the vector. Besides mouse strain, animal gender has also been shown to influence AAV mediated gene delivery. This study demonstrates no gender specific differences in transgene expression post AAV2/9 mediated gene delivery. Though there was a threefold higher gene delivery as measured by real time PCR, 10-50 fold higher expression was observed in female mice compared to their male counterparts, but all results were insignificant. Further, no significant difference in expression was observed when AAV2/9 was delivered to inflamed lungs of SPB-mice. These results point to the resistance of AAV2/9 to pulmonary inflammation. NAB development is a major limitation of viral vectors and inhibits vector readministration. Pulmonary route of administration had no influence on NAB development, as demonstrated in BALB/c-mice. By using 10- and 100-fold lower doses, significantly reduced NAB titers were achieved but lower doses also resulted in drastically reduced transgene expression. In SPB-mice, by using transient immunosuppression with dexamthasone, the development of NABs was significantly inhibited in both gender types thereby overcoming a major hurdle in the way of using AAV based vectors for gene therapy. In contrast to transgene expression and NAB development which were unaffected by the pulmonary route of application, biodistribution studies showed a trend for higher delivery to the lungs combined with lower deposition in spleen and liver when using the intratracheal route. Using real time PCR mediated vector quantification and in vivo bioluminescence imaging, systemically distribution post pulmonary gene delivery and persistent gene expression in various organs of the vector was observed. These findings bode well for the application of AAV2/9 based vectors, where long-term transgene expression is desired. The performance of AAV2/9 in the presence of lung inflammation gives hope for use in a therapeutic setting. Prior to clinical application, strategies need to be developed that limit viral biodistribution and immunogenicity.