Detektion und genetische Charakterisierung von neuen Herpesviren in Primaten

Abstract

Die Entdeckung bisher unbekannter LCV bei Primaten hatte vor ca. zehn Jahren zu der Hypothese geführt, dass sich LCV von Primaten in drei Genogruppen gliedern: eine Genogruppe bestand aus LCV von Neuweltaffen (Genogruppe III) und zwei weitere aus LCV von Altweltaffen (Genogruppen I und II). Zur Genogruppe I zählten zahlreiche LCV aus hominoiden Primaten, inklusive EBV. Die Genogruppe II war kleiner und umfasste LCV aus einigen hominoiden Primaten, aber nicht aus Schimpansen oder Menschen. Gorilla LCV existierten in beiden Genogruppen, was zu der Hypothese führte, dass neben EBV ein weiteres humanes LCV existieren könnte. In dieser Arbeit wurde diese Hypothese durch zwei experimentelle Aufgabenstellungen überprüft. Zum einen wurde nach unbekannten LCV der zweiten Genogruppe in Menschenaffen gesucht. Zum anderen wurden von LCVs Sequenzinformationen gewonnen, die mindestens eine Spanne von vier Genen umfassen, um die Qualität der phylogenetischen Analyse von LCVs zu verbessern. Für die Suche nach unbekannten LCV der Genogruppe II wurde eine Optimierung des Genomnachweises durch die Entwicklung von degenerierten Primern, abgestimmt auf die Erfassung von LCV der Genogruppe II, erlangt. Dadurch konnten in PCR-Reaktionen mit einer hohen Effizienz alle bekannten LCV der Genogruppe II detektiert werden. Untersuchungen von Schimpansen-Proben zeigten aber, dass offenbar kein Schimpansen-LCV der Genogruppe II existiert. Für phylogenetische Analysen wurden zunächst zusätzliche LCV- Sequenzinformationen vom MDBP- bis DPOL-Gen generiert. Es folgte die Identifizierung des gB-Gens und darauf basierend die phylogenetische Analyse. Der Stammbaum zeigte die Einteilung von LCV aus hominoiden Primaten in zwei Genogruppen und die Eingruppierung von LCV aus Schimpansen oder vom Menschen in die Genogruppe I. Die Ergebnisse aus beiden Aufgabenstellungen belegten, dass die aufgestellte Hypothese eher unwahrscheinlich ist und dass neben EBV kein weiteres humanes LCV existiert. Der vGPCR von EBV, kodiert vom BILF1-Leserahmen, signalisiert Liganden unabhängig und ist konstitutiv aktiv. Diese funktionellen Merkmale waren mit der EBV-assoziierten Tumorgenese in Zusammenhang gebracht worden. Hier wurden vGPCRs von LCV aus Menschenaffen identifiziert und ihre Eigenschaften im Vergleich zu BILF1 charakterisiert. Es wurden gleiche konservierte Eigenschaften der vGPCRs auf molekularer Ebene aufgezeigt, wie die konstitutive Aktivität, die Signalweitergabe über die Gαi- Untereinheit, die konstitutive Internalisierung in die Zelle und eine erhöhte Aktivierung von CREB und NFκB bei einer zellulären Expression der vGPCRs. Weiterhin konnte für BILF1 und den HsynLCV1-GPCR ein zum Teil intrazelluläres Lokalisationsmuster und eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT bestimmt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der HsynLCV1-GPCR die Aktivität von NFAT über zwei Untereinheiten, Gαi und Gαq, induziert. Durch die Beobachtung, dass vGPCR-Eigenschaften, für die eine Verbindung zu Tumorgenese angenommen wird innerhalb der untersuchten vGPCRs konserviert sind, wurde das Potential dieser vGPCRs bestätigt. Des Weiteren konnte durch die Charakterisierung des HsynLCV1-GPCR und die bessere Charakterisierung des BILF1 nicht nur ein besseres Verständnis von LCV-GPCRs erlangt werden, sondern es konnten auch Parallelen zu vGPCRs, kodiert von β- bzw. γ-Herpesviren, aufgezeigt werden, die mit Tumorgenese in ihrem Wirt assoziiert sind.

Ten years ago the discovery of so far unknown lymphocryptoviruses (LCVs) of primates led to a new theory on LCV evolution. The new LCVs from primates were divided into three genogroups: one genogroup consisted of LCVs from new world monkeys (genogroup III) and the other two genogroups included LCVs from old world monkeys (genogroup I and II). The first genogroup consisted of numerous LCVs from hominoid primates, including Epstein-Barr virus (EBV). The second genogroup was smaller and also contained LCVs from hominoid primates, but no human or chimpanzee LCV. Gorilla LCVs existed in both genogroups, which led to the hypothesis that another human LCV besides EBV might exist. In this thesis the hypothesis was tested using two experimental approaches: (I) a screening for hitherto unknown LCVs of the second genogroup in great apes and (II) an improvement of the quality of the phylogenetic studies by sequence generation using a four-gene block. In the search of unknown LCVs an optimisation of the detection of LCV was achieved by developing degenerate primers, which were highly efficient in detecting known LCVs of the second genogroup. However no chimpanzee LCV of the second genogroup was detected. Therefore, the existence of such a LCV in chimpanzees, the closest relative of the human, is rather unlikely. LCV sequence information from the MDBP-DPOL genes were generated followed by the identification of the gB gene and subsequent phylogenetic analysis. The phylogenetic tree showed a statistically well-supported location of LCVs in two genogroups, but no so far unknown of chimpanzee or human LCVs in the second genogroup. The results from both approaches suggest that the initial hypothesis of a second human LCV is rather unlikely. The viral G protein-coupled receptor (vGPCR) BILF1, encoded by EBV, signals in a ligand independent manner and is constitutively active. These functional features had been linked with the EBV-assoziated tumorgenesis. vGPCRs of LCV from great apes were identified here and their characteristics in comparison to those of BILF1 were investigated. Uniform functional characteristics of the vGPCRs were found such as the constitutive activity, the signal transduction via Gαi, the constitutive internalisation of the vGPCRs and a higher level of transcriptional activity of CREB and NFκB following vGPCR expression. Furthermore the results showed that BILF1 and HsynLCV1-GPCR differ in their intracellular localisation patterns and that only these receptors of those investigated can activate the transcription factor NFAT. In addition it was shown that HsynLCV1-GPCR can induce the NFAT activity via two Gα subunits, Gαi and Gαq. The determination of the conserved characteristics within the LCV- GPCR family, which are correlated with tumorigenesis, confirmed the high oncogenic potential of these vGPCRs. The further characterisation of BILF1 and the HsynLCV1-GPCR led not only to a better understanding of BILF1, but also to a better common understanding of vGPCRs encoded by β and γ-herpesviruses, which are associated with tumorigenesis in their hosts.