Untersuchungen zur Regulation von Klasse I Phosphoinositid-3-Kinasen in vivo

Abstract

Die Rezeptor-regulierten Klasse I PI-3-Kinasen generieren das Membranlipid PtdIns-3,4,5-P3, was zur Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Effektoren mit hieran bindenden PH-Domänen führt. Auf diese Weise kontrollieren sie wichtige zelluläre Prozesse wie Wachstum, Differenzierung oder cytoskelettale Veränderungen. Ihre Regulation und Funktion ist aber erst unvollständig verstanden. Da die Klasse I PI-3-Kinasen vorwiegend im Cytosol gefunden werden, ging man davon aus, daß sie zunächst selbst an die Membran zu ihrem Substrat rekrutiert werden, was in der vorliegenden Arbeit erstmals mittels Fluoreszenz-mikroskopischer Untersuchungen in lebenden Zellen gezeigt wurde. Die heterodimeren Klasse I PI-3-Kinasen werden nach ihren nicht-katalytischen Untereinheiten weiter eingeteilt: Die Klasse IA PI-3-Kinasen α, β und δ werden typischerweise durch Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) aktiviert, wobei ihre nicht-katalytische p85-Untereinheit als Adapter fungiert, der über SH2-Domänen die Interaktion mit dem phosphorylierten Rezeptor vermittelt. Entsprechend wurde hier am Beispiel der PI-3-Kinase β die RTK- und p85-vermittelte Translokation des heterodimeren Enzyms aus dem Cytosol an die Membran gezeigt. Die einzige bekannte Klasse IB PI-3-Kinase γ hat anstelle der p85- eine p101-Untereinheit und wird typischerweise über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch Gβγ-Komplexe stimuliert. Hierbei war umstritten, welche Rolle die p101 spielt, und ob Gβγ das Enzym ebenfalls an die Membran rekrutiert und hierdurch aktiviert. Es wurde gezeigt, daß Gβγ die PI-3-Kinase γ tatsächlich aus dem Cytosol an die Membran rekrutiert, und zwar durch Interaktion mit ihrer p101-Untereinheit, die insofern also ebenfalls als Adapter fungiert. Zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität und Rezeptor-vermittelten Aktivierung der Klasse I PI-3-Kinasen wurde die PtdIns-3,4,5-P3-Bildung durch die Membrantranslokation von hieran bindenden markierten PH-Domänen sichtbar gemacht und auf diese Weise gezeigt, daß die p101 auch für die G-Protein- vermittelte Aktivierung der PI-3-Kinase γ in vivo notwendig ist. Eine künstlich Membran-assoziierte PI-3-Kinase γ war bereits ohne Stimulation enzymatisch aktiv, konnte aber durch Gβγ noch weiter stimuliert werden, offenbar also durch einen allosterischen Mechanismus. Beides war unabhängig von der An- oder Abwesenheit der p101. Gβγ interagiert also auch direkt mit der katalytischen p110γ-Untereinheit, nur offenbar zu schwach, um sie p101-unabhängig an die Membran zu rekrutieren. Somit läßt sich ein Zwei- Schritt-Modell für die Aktivierung der PI-3-Kinase γ durch Gβγ ableiten: Im ersten Schritt rekrutiert Gβγ die PI-3-Kinase γ aus dem Cytosol an die Membran, und zwar durch Interaktion mit ihrer p101-Untereinheit, die hierfür als Adapter fungiert. Bereits die Colokalisation der Lipidkinase mit ihrem Substrat führt zu einer signifikanten PtdIns-3,4,5-P3-Bildung. An der Membran wird die PI-3-Kinase γ aber von Gβγ noch weiter aktiviert, und zwar durch direkte Interaktion mit der katalytischen p110γ-Untereinheit.

Receptor-regulated class I PI-3-kinases produce the membrane lipid PtdIns-3,4,5-P3. This in turn induces recruitment and activation of diverse cellular effectors harboring PtdIns-3,4,5-P3-binding PH domains. Thereby, class I PI-3-kinases control important cellular functions such as growth, differentiation or cytoskelettal rearrangements. However, since PI-3-kinases have only recently been discovered, their regulation and function are not fully understood. Since class I PI-3-kinases are predominantly found in the cytosol, it has been assumed that they are recruited from the cytosol to the membrane, i. e. to their substrate, upon stimulation. This was shown here for the first time in living cells using fluorescence microscopy. Class I PI-3-kinases are heterodimeric enzymes, and are further classified according to their type of non-catalytic subunit: The p85 non-catalytic subunit of the class IA PI-3-kinases α, β and δ mediates their characteristic activation by receptor tyrosine kinases through interaction of its SH2 domains with the autophosphorylated receptor. Accordingly, using PI-3-kinase β as an example, it was shown here that upon RTK stimulation the heterodimeric enzyme indeed translocates from the cytosol to the plasma membrane in a p85-dependent manner. The only known class IB PI-3-kinase to date is PI-3-kinase γ. Instead of p85 it has a p101 subunit, and is typically activated via G protein-coupled receptors by Gβγ complexes. It is controversely discussed which role the non- catalytic p101 subunit plays, and whether PI-3-kinase γ is also membrane- recruited by Gβγ and activated in this way. Here it was shown that Gβγ recruits PI-3-kinase γ from the cytosol to the membrane, namely through interaction with its non-catalytic p101 subunit. In this respect p101 functions as an adapter, comparable to the role of the p85 subunit of class IA PI-3-kinases. To study the enzymatic activity and receptor-mediated activation of class I PI-3-kinases, PtdIns-3,4,5-P3 production was monitored by membrane translocation of fluorescence-tagged PtdIns-3,4,5-P3-binding PH domains. Using this method it was shown that the p101 subunit is also required for the G protein-mediated activation of PI-3-kinase γ in vivo. A membrane-targeted PI-3-kinase γ mutant displayed enzymatic activity without further stimulation, but was further stimulated by Gβγ, indicating an allosteric activation at the membrane. Both, basal activity and further stimulation of the membrane- targeted enzyme were independent of the absence or presence of p101. Hence, Gβγ directly interacts with the catalytic p110γ subunit - although with a weaker affinity than p101, which therefore acts a high affinity adapter mediating the membrane recruitment of the heterodimeric enzyme. In conclusion, a two-step model for the activation of PI-3-kinase γ by Gβγ is postulated, with specific roles for either subunit: As a first step, Gβγ recruits the enzyme from the cytosol to the membrane through interaction with its non- catalytic p101 subunit as a mandatory adapter. As a consequence of its intrinsic basal enzymatic activity, the colocalization of the lipid kinase with its substrate readily induces some PtdIns-3,4,5-P3 production. However, at the membrane, PI-3-kinase γ is further allosterically activated by Gβγ by direct interaction with its catalytic p110γ subunit.