Elektronenmikroskopische Analyse des Remodeling eines freien Sehnentransplantates nach Ersatz des vorderen Kreuzbandes unter lokalem Einfluss von platelet- derived growth factor (PDGF-BB)

Abstract

Beim Menschen ist die Verletzung des vorderen Kreuzbandes (VKB) das häufigste Trauma des Kniegelenkes. Sie wird mangels Spontanheilung zunehmend durch eine Rekonstruktion mit Hilfe autologer Sehnentransplantate versorgt. Entgegen dem bekannten positiven Einfluss von platelet-derived growth factor (PDGF) bei der Wundheilung, wurde dies bei der Heilung eines freien Sehnentransplantates bisher nicht nachgewiesen. Ziel der Arbeit war es, elektronenmikroskopisch den Einfluss von PDGF-BB auf die strukturelle Transformation und Wiederherstellung eines freien Sehnentransplantates nach einer Rekonstruktion des VKB in vivo zu untersuchen. Dazu wurde bei 48 ausgewachsenen Schafen das VKB durch ein Transplantat aus der Endsehne des M. flexor digitalis superficialis ersetzt. Die Tiere wurden in acht Gruppen eingeteilt, von denen vier als Kontrollgruppen und vier als Versuchsgruppen dienten, in deren Transplantate lokal 60 µg PDGF-BB appliziert wurde. Je zwei Gruppen wurden 3, 6, 12 und 24 Wochen post op. eingeschläfert. Anschliessend wurden transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen von Transplantatquerschnitten vorgenommen. Nach standardisierter Materialaufarbeitung wurden von jeder Probe sechs Fotografien angefertigt, die digital auf 80.000 vergrössert und danach ebenfalls digital ausgewertet wurden. Als Messparameter dienten die Anzahl kollagener Fibrillen/µm2, der Fibrillendurchmesser, die Fibrillenfläche/µm2 und die Verteilung der verschiedenen Fibrillendurchmesser. Bänder und Sehnen unterscheiden sich strukturell und mechanisch voneinander. Ultrastrukturell unterschieden sich die beiden Gewebe signifikant nur in der Fibrillenfläche bei ansonsten ähnlichen Messparametern. Deshalb wird die Flexorsehne auch aus transmissionselektronen-mikroskopischer Sicht als geeignetes VKB-Ersatzgewebe erachtet. Die in der Studie als VKB-Ersatz eingesetzte Flexorsehne zeigte biomechanisch eine deutlich höhere Versagenskraft als das native VKB. Ultrastrukturell erfolgte die Transformation der Flexorsehne nach ihrer Transplantation in VKB-Position überwiegend in den ersten 12 Wochen post op. Innerhalb der ersten sechs Wochen post op. war sie durch einen weitgehenden Strukturverlust des Transplantates, Verringerung der Fibrillenanzahl, Zunahme des Fibrillendurchmessers und der Fibrillenfläche gekennzeichnet. Die Verteilung der Fibrillendurchmesser hatte sich in Richtung der Fibrillen mit einem Durchmesser > 140 nm verschoben. Anschliessend folgte eine Restrukturierungsphase, die sich durch eine signifikante Steigerung der Fibrillenanzahl, Verringerung des Fibrillendurchmessers und der Fibrillenfläche bei absoluter Dominanz der dünnen Fibrillen mit einem Durchmesser von 20-60 nm auszeichnete. Was die Wirkung des applizierten PDGF angeht, so waren die strukturellen Veränderungen bei den Kontroll- und Versuchsgruppen grundsätzlich ähnlich, wobei die Transplantate 24 Wochen post op. die morphologischen Eigenschaften des intakten VKB noch nicht erlangt hatten. Der wesentliche Unterschied lag in der um drei Wochen früheren Restrukturierung und einer nach 12 Wochen signifikant höheren Fibrillenanzahl der Transplantate aus den PDGF-behandelten Versuchsgruppen. Die Unterschiede zwischen den PDGF-behandelten und den Kontrolltransplantaten, lassen auf eine förderliche Wirkung von PDGF schliessen. Flankierende Untersuchungen der Arbeitsgruppe hinsichtlich biomechanischem Verhalten und histologischen Veränderungen des Transplantates im Zeitverlauf bestätigten die eigenen ultrastrukturellen Beobachtungen in den Grundaussagen. Um die Wirksamkeit von PDGF, seine Konzentration und Kinetik sowie die Wirkung von PDGF alleine oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren bei der Transplantatheilung in vivo noch genauer zu verfolgen, müssen noch weitere Studien durchgeführt werden. Insgesamt zeigte sich jedoch, dass die lokale Applikation von PDGF sich positiv, wenn auch nicht stark ausgeprägt auf die Transplantatheilung auswirkte und der Einsatz dieses Wachstumsfaktors Möglichkeiten eröffnet, speziell in der frühen postoperativen Phase, die strukturellen und mechanischen Eigenschaften eines Kreuzbandersatzes zu verbessern.

Injury to the anterior cruciate ligament (ACL) is the most frequent trauma of the knee joint in humans. Due to its inability to heal spontaneously, surgical treatment of ACL injuries is constantly increasing. Although the positive influence of platelet-derived growth factor (PDGF) on wound healing has been proved, up to date there is no data of its influence on the healing of a free tendon graft. The objective of the study was to electron microscopically evaluate the effect of PDGF-BB on the structural transformation and recovery of a free tendon graft after ACL reconstruction in vivo. In 48 sheep with skeletally mature hindlegs, the ACL was reconstructed using the superficial digital flexor tendon. The animals were divided into eight groups four of which served as control groups and four served as study groups. The grafts of the study groups received a local dose of 60 µg of PDGF-BB. Two groups each were sacrificed 3, 6, 12 and 24 weeks postoperatively. Subsequently, electron microscopical evaluation of cross sections of midsubstance graft tissue samples was performed. Following standardized sample processing, six photomicrographs of randomly selected areas were taken and digitally analyzed at a magnification of 80,000. The following parameters were determined: total number of collagen fibrils/µm2, fibril diameter, fibril area/µm2 and distribution of the different fibril diameters within the graft. Ligaments and grafts are structurally and mechanically different. With regard to ultrastructure, only the fibril area/µm2 of the two tissues was significantly different, whereas all other parameters were similar. The flexor tendon used in this study presented a significantly higher failure load compared to the intact ACL. Based on these findings, also from an electron microscopical point of view, the digital flexor tendon is considered to be a suitable graft for ACL reconstruction. Ultrastructurally, after reconstruction of the ACL, transformation of the flexor tendon graft took place primarily in the first 12 weeks postoperatively. Within the first six weeks, it was characterized by a large structural loss, decrease in number of fibrils, increase in fibril diameter and fibril area. Distribution of the different fibril diameters had shifted towards fibrils > 140 nm. This phase of degeneration was followed by a phase of regeneration, characterized by a significant increase in numbers of collagen fibrils, decrease in fibril diameter and fibril area, and absolute dominance of thin fibrils with a diameter of 20-60 nm. In terms of PDGF application, the structural alterations of the graft after ACL reconstruction was similar in both groups, however, the graft had not reached the morphological features of a the native ACL. The most striking difference between the control and study groups was the fact that the latter one underwent reconstruction three weeks earlier and presented a significantly higher number of collagen fibrils 12 weeks post surgically compared to the control groups. The differences between the study and control groups suggested a positive, albeit not very pronounced influence of PDGF on graft healing. Accompanying evaluations of the research group in terms of biomechanical and histological changes of the graft post surgically, confirmed the fundamental assertions of the own ultrastructural results. In order to more accurately assess the potency of PDGF, its concentration and kinetics as well as its effectiveness alone or in combination with other growth factors on graft healing in vivo, further studies will have to be done. In conclusion it can be stated, however, that the local application of PDGF had a positive influence on graft healing and especially in the early postoperative healing phase, this growth factor provides opportunities, to enhance the structural and mechanical characteristics of a reconstructed ACL.