Mukosale Genexpression während der porcinen postnatalen Darmentwicklung und Einfluss einer Probiotikagabe

Abstract

Während der postnatalen Darmentwicklung und Absetzphase bei Schweinen sind eine epitheliale Oberflächenintegrität und eine angemessene mukosale Immunantwort kritisch für den Schutz vor Darmkrankheiten und Infektionen, so dass die Erforschung potenzieller Regulatoren von großer Bedeutung ist. Im Darm werden Trefoil Factor Family Peptide (TFF1, TFF2 und TFF3) nach mukosaler Verletzung hochreguliert und regenerieren die Oberflächenintegrität durch Induktion zellulärer Restitution. Eine Regulation der mukosalen Immunantwort durch TFFs könnte bei Entzündungen in der Absetzphase relevant sein. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der postnatalen TFF Expression im Ferkeldarm unter Einfluss einer Probiotikabehandlung. Das Probiotikum E. faecium NCIMB 10415 oder ein Placebo (N=5) wurde verabreicht und Intestinalproben an sechs Zeitpunkten gewonnen (7-56d). Sowohl auf Transkriptions-, als auch auf Translationsebene wurde die Genexpression mittels qRT-PCR und Western Blotting analysiert. Eine Lokalisationsstudie wurde immunhistochemisch durchgeführt. In frühen Entwicklungsphasen wurden niedrige TFF2-Konzentrationen gemessen, während bis zu 28-fach erhöhte Expressionwerte nach dem Absetzen vorlagen. Die Absetzphase wurde mit einer erhöhten TFF3-Expression assoziiert, während die TFF1-Expression unterhalb der Detektionsgrenze der angewendeten Methode lag. TFF2-Expressionsmuster korrelierten mit der Expression von Genen, die in TFF-Signaltransduktionswege involviert sind. Die Probiotikaapplikation hatte keinen Einfluss auf die TFF- Expression. Die Steuerung der Genexpression ist essenziell für normales Wachstum und Entwicklung. Erst seit kurzer Zeit ist die Bedeutung von MicroRNAs (miRNAs) als wichtige eukaryotische Genregulatoren aufgedeckt worden. Jedoch ist nur wenig über miRNA Sequenzen des Schweinegenoms bekannt. Die Identifizierung und Quantifizierung porciner miRNAs kann neue Erkenntnisse über die post-transkriptionale Genregulation von Prozessen liefern, die mit der postnatalen Darmentwicklung verknüpft sind. Ein weiteres Ziel war daher eine schnelle und zuverlässige Methode für die Klonierung von kleinen RNAs zu entwickeln, die weitergehende Analysen im porcinen System in dieser Arbeit ermöglichte. Dieser neuartige Klonierungsansatz ermöglicht auf der Basis der Synthese von Nukleinsäuren durch Assemblierung von fünf DNA-Molekülen in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) das gleichzeitige Klonieren von bis zu fünf miRNA-Molekülen. Mit dieser Methode konnten mehrere neue porcine miRNAs erstmalig beschrieben werden. Methoden zur Quantifizierung von miRNAs wurden hauptsächlich für die Spezies Mensch und Maus verwendet. Aus diesem Grund wurde eine neue hochsensitive Alternativmethode entwickelt, die eine speziesübergreifende miRNA Analyse auf der Basis der quantitativen PCR ermöglicht, so dass eine valide miRNA Expressionsanalyse im porcinen Gewebe im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt werden konnte.

The postnatal period of pigs poses many challenges mostly associated with weaning. Maintaining integrity of the intestinal epithelial surface and an appropriate mucosal immune response are critical processes in preventing digestive disorders and infections. Because of the high incidence of enteric diseases in animal health, the study of potential regulators of intestinal development is of great importance. Trefoil factor family peptides (TFF1, TFF2 and TFF3) are expressed in specific regions of the gastrointestinal tract. TFFs are rapidly up-regulated in response to mucosal damage, enhancing the surface integrity of gastrointestinal mucosa by cell restitution. TFFs presumably regulate mucosal immune response, which is critical at weaning. Our aim was to evaluate porcine mucosal TFF expression during the postnatal period. In addition, the influence of a probiotic treatment was investigated. Piglets were treated with the probiotic strain E. faecium NCIMB 10415 or a placebo (n=5) and weaned at 28 days of age. Intestinal tissue samples were collected at 6 time points (7-56d). Total RNA and protein were isolated and gene expression analyzed by qRT-PCRs and Western Blotting. A localization study of TFF2 was performed using immunohistochemistry. TFF2 levels were low during early maturation stages, while TFF2 expression increased up to 28-fold after weaning. Weaning could be associated with increased TFF3 levels, while TFF1 expression was below the detection limit of the applied assay. However, TFF expression remained unaffected by probiotic treatment. Interestingly, expression of TFF2 correlated with TFF pathway-related genes. These results indicate that TFF might play a role in regulating intestinal immune response and enhancing mucosal repair after weaning in pigs. Regulation of gene expression is essential for growth and development. Recently, the role of single-stranded small noncoding RNAs called microRNAs (miRNAs) as major regulators in eukaryotic gene expression has been revealed. However, only few porcine miRNAs are discovered to date. Identification and quantitation of miRNAs can provide a broader knowledge of post-transcriptional gene regulation influencing processes linked to postnatal intestinal development. In this context, another aim was to develop a novel tool for cloning of small RNA molecules in order to create a miRNA library for pigs. This method is based on simultaneous cloning of up to five molecules within the same clone. Using this method, we have discovered several novel porcine miRNAs. Quantification methods for miRNAs currently include assays that mainly cover miRNAs from humans and mice. Consequently, our aim was to develop a new and highly sensitive and specific quantitative PCR method, which enables the analysis of various species such as pigs in order to quantify miRNA expression in porcine tissues of our present project.