Generation and Characterization of KCa3.1-transgenic mice

Abstract

The KCa3.1, an intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, is expressed in many tissues and organs and is presumably involved in the control of secretory processes in epithelia, cell volume regulation, the immune response and the control of cell proliferation of many cell types. The KCa3.1 is also expressed in the cardiovascular system and especially in the endothelium. The endothelial KCa3.1 is believed to mediate EDHF-type vasodilation by inducing endothelial membrane hyperpolarization. The present work aimed to generate a KCa3.1-knockout mouse and to investigate the functional role of endothelial KCa3.1 in the vasculature and in blood pressure control. For gene targeting of the KCa3.1 gene located on chromosome 7 of the mouse genome, exon 4, which codes for the channel pore, was deleted by homologous recombination using a pTV5-targeting vector in E14.1 embryonic stem cells. A positive clone was identified and injected into blastocysts of pseudo-pregnant foster females. Chimeric animals were bred to wild-type C57Bl/6 mice and gave heterozygous animals thus demonstrating successful germ line transmission. Further inbreeding gave homozygous KCa3.1-/- mice. Genotyping of the KCa3.1-/- mice revealed successful deletion of exon 4 as demonstrated by PCR and southern blot analysis. Loss of KCa3.1-mRNA- expression was proved by RT-PCR. Electrophysiological patch-clamp studies revealed the loss of KCa3.1 currents and thus channel function in native T-lymphocytes. KCa3.1-/- mice were viable and fertile. Macroscopic and histological examinations revealed splenomegaly in both male and female KCa3.1-/- mice when compared to wild-type littermates. Moreover, weights of heart and kidney were significantly increased in female KCa3.1-/- mice, but not in KCa3.1-/- males, thus indicating a gender-specific phenotype. Cardiovascular phenotyping showed a significant reduction of KCa functions in aortic endothelial cells from female KCa3.1-/- mice. Pressure myography revealed a significantly impaired EDHF-mediated vasodilation in carotid artery of female KCa3.1-/- mice. KCa functions in endothelial cells and EDHF-mediated vasodilation were not significantly impaired in male KCa3.1-/- mice. Tail-cuff plethysmography and telemetry showed elevated systolic blood pressure in female KCa3.1-/- mice, but not in male KCa3.1-/- mice. In conclusion, a KCa3.1-/- mouse strain has been successfully generated by the conventional gene targeting strategy. By using this transgenic animal model, the present work shows that KCa3.1 plays a pivotal role in EDHF-mediated vasodilation and the control of the systemic blood pressure in a gender-specific manner.

Der KCa3.1, ein Ca2+-aktivierter K+ Kanal mit intermediärer Leitfähigkeit ist in vielen Geweben und Organen exprimiert. Es wird angenommen, dass der KCa3.1 an der Steuerung von Sekretionsprozessen in Epithelien, der zellulären Volumenregulation, der Immunantwort und von Zellproliferationsprozessen beteiligt ist. Der KCa3.1 ist auch im kardiovaskulären System und insbesondere im Endothel exprimiert. Der endotheliale KCa3.1 scheint hier durch eine Hyperpolarisation der Zellmembran die sog. endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF)-mediierte Vasodilatation zu vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine KCa3.1- knockout -Mauslinie generiert, um die funktionelle Bedeutung des endothelialen KCa3.1 im Blutgefäßsystem und für die Blutdruckregulation zu untersuchen. Für das sog. gene targeting des KCa3.1-Gens auf Chromosom 7 des Mausgenoms, wurde Exon 4, welches für die Kanalpore kodiert, mittels eines pTV5-Vektors und homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen (E14.1) deletiert. Ein positiver Klon wurde selektiert und in Blastozysten scheinschwangerer Weibchen injiziert. Chimärer Nachwuchs, der mit Wildtyp Mäusen (C57Bl/6) verpaart wurde, zeugte heterozygote KCa3.1+/- Nachkommen. Das veränderte Gen wurde somit über die Keimbahn vererbt. Über Inzucht heterozygoter Tiere, wurden homozygote KCa3.1-/--Tiere generiert. Mittels PCR und southern blot -Analysen wurde die erfolgreiche Deletion des Exon 4 des KCa3.1-Gens in diesen Tieren nachgewiesen. Ein Fehlen der mRNA-Expression und des funktionellen Kanalproteins wurde mittels RT-PCR bzw Patch-clamp Untersuchungen an naiven T-Lymphozyten gezeigt. Die KCa3.1-/--Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar. Grob makroskopische und histologische Untersuchungen zeigten eine deutliche Vergrösserung der Milz bei männlichen und weiblichen KCa3.1-/--Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Geschwistern. Darüber hinaus wurde bei weiblichen, jedoch nicht bei männlichen Tieren ein signifikant höheres Herz- und Nierengewicht festgestellt. Dies deutet daraufhin, dass hier ein geschlechtsspezifischer Phänotyp vorliegt. Die kardiovaskuläre Phänotypisierung ergab, dass KCa- Funktionen in aortalen Endothelzellen von weiblichen KCa3.1-/--Mäusen signifikant reduziert waren. Untersuchungen im Druck-Myographen wiesen eine signifikante Verminderung der EDHF-mediierten Vasodilatation nach. Endotheliale KCa-Funktionen und die EDHF-mediierte Vasodilatation war bei männlichen KCa3.1-/--Mäusen nicht signifikant verändert. Blutdruckmessungen mittels der Schwanzmanschetten- Plethysmographie und Telemetrie zeigten einen signifikant erhöhten systolischen Blutdruck bei weiblichen, aber nicht bei männlichen KCa3.1-/--Mäusen. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit eine KCa3.1-/--Mauslinie erfolgreich generiert werden. Eine kardiovaskuläre Phänotypisierung ergab, dass der endotheliale KCa3.1 geschlechtsspezifisch eine wichtige Rolle bei der EDHF-mediierten Vasodilatation und damit bei der Blutdruckregulation spielt.