Entwicklung eines Autoantikörper-Multiplex-ELISA ́s zur Diagnostik von Kardiomyopathien

Abstract

Bei der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) sollen in ca. 50 % kardiale Autoantikörper pathogenetisch von Bedeutung sein. Die Diagnose erfolgt durch eine Endomyokardbiop- sie. Für den serologischen Nachweis gibt es zurzeit nur wenige Einzel-ELISA-Methoden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Multiplex-ELISA zu entwickeln, der mehrere Autoantikö- per bei Patienten mit DCM detektieren und quantifizieren kann. Es wurden für fünf in der Literatur als kardiale Autoantigene bekannte Proteine (Adenin- Nucleotid-Translokase, ß1-adrenerger Rezeptor, kardiales Myosin und kardiales Tropo- nin insgesamt acht Peptide (10-29 Aminosäuren lang) ausgewählt. Diese Antigene wur- den in einem Kopplungsverfahren an verschiedenfarbige fluoreszenz-markierte Mikro- partikel (Beads) gebunden, die später eine Zuordnung zum untersuchten Analyten zulassen. In Patientenseren vorhandene Autoantikörper sollen an die Peptide binden, werden mit einem Zweitantikörper markiert und durch eine durchflusszytometrisches Ver- fahren (Luminex-Technologie) vermessen. Im ersten Schritt wurden die jeweiligen Ein- zelnachweise entwickelt und optimiert. Später wurde dieser Einzeltest zu einem multipa- rametrischen Test vereint, welche dann die parallele Messung von acht Autoantikörpern in Patientenseren ermöglicht. Mit diesem Multiplex-Test wurden dann Seren von 78 myokardbioptisch eindeutig cha- rakterisierten Patienten aus vier Untersuchungsgruppen untersucht: DCM, akute Myokar- ditis (MCa), Myokarderkrankungen mit positivem Virusnachweis und definierte Kontrollen (ohne Virus, ohne Entzündung). Die Fluoreszenzwerte der Autoantikörper-Tests wurden zu den klinischen Angaben korreliert. Die Standardisierung der Methode war bei optimier- ten Verdünnungen der Humanseren und der genutzten Agenzien möglich. Die Inter- und Intraassay-Varianz betrug ca. 10%. Die Korrelation zum einzig verfügbaren kommerziel- len Einzel-ELISA für den ß1-adrenergen Autoantikörper war hochsignifikant. Ebenfalls korrelierten einige der Autoantikörperkonzentrationen zu bioptischen Diagnosen. Der Antikörper gegen den beta1-adrenergen Rezeptor konnten bei 48 % der DCM-Pati- enten nachgewiesen werden, in der Virusgruppe betrug der Anteil sogar 49 %. Aber auch 33 % der MCa-Patienten waren positiv. Somit hat sich eine vorrangige Repräsentanz dieses Autoantikörpers bei diesen Krankheitsgruppen gezeigt. Einige Patienten der DCM und besonders der Virusgruppe (überwiegend Coxsackievirus) wiesen hohe Antikörper- spiegel für eine Sequenz von kardialem Myosin auf. Bemerkenswerterweise waren bei der MCa-Autoantikörper gegen mehrere Peptide (Adenin-Nukleosin-Translokase, kardi- ales Myosin, kardiales Troponin) praktisch nicht nachweisbar. In dieser Arbeit wurde erstmalig ein multiparametrischer ELISA für Autoimmunantikörper bei Kardiomyopathie entwickelt. Es wurden kurze Peptidbereiche des Gesamtproteins als myokardiale Antigene gewählt. Daher war es nur möglich, Autoantikörper in den vorlie- genden Humanseren gegen diese definierten Peptide zu detektieren. Somit sind Aussa- gen über andere Autoantikörper gegen diese Struktureiweiße nicht möglich. Zusätzlich gibt es keine weiteren Vergleichsmöglichkeiten zu der angewandten Methode und der Ergebnisse. Der hier dargestellte Multiplex-ELISA stellt ein wichtiges Element zur zukünf- tigen Diagnostik kardialer Autoimmunerkrankungen dar.

In the pathogenesis of dilated cardiomyopathy (DCM) cardiac autoantibodies are de- scribed as relevant in about 50 percent. The current diagnosis of DCM patients is per- formed by endomyocardial biopsy (EMB). For autoantibodies, only ELISA methods for single peptides are existing. Aim of this study was to develop a Multiplex ELISA which was able to detect multiple autoantibodies in sera of DCM patients. For five in the literature described proteins known as cardiac autoantigens (adenine nu- cleotide translocase, beta-1 adrenergic receptor, cardiac myosin and cardiac troponin) in total eight peptides (with the length of 10 to 29 amino acids) have been chosen. These antigens have been coupled to different-coloured fluorescence-labelled microparticles (beads) which admit later an allocation to the analyt. In patient sera, existing antibodies should bind to the peptides, are marked with a second antibody and measured by a flow cytometry method (Luminex technology). In the first step the respective individual anal- yses were developed and optimized. Later, this single test was combined into a multipa- rametric test, which then allows the parallel measurement of eight autoantibodies in pa- tient sera. With this multiplex test then sera were examined from 78 by myocardial biopsy clearly characterized patients of four study groups: DCM, acute myocarditis (MCa), myocardial diseases with positive virus detection and defined controls (without virus, without inflam- mation). Fluorescence values of autoantibody tests were correlated to clinical data. Standardisation of the method was possible with optimized dilutions of human sera and used agents. Inter- and intra-assay variance was approximately 10 %. The correlation to the only available commercial single ELISA for beta1-adrenergic autoantibody was highly significant. Also, correlated some of the antibody concentrations to the EMB diagnoses. ß1-adrenergic autoantibodies were identified in 48 % in DCM patients, proportion in the virus group was 49 %. In the group with MCa 33 % of sera were positive. Several patients of the DCM group and especially of the virus group (mostly coxsackie virus) featured high levels for cardiac myosin autoantibodies. Remarkably, the acute myocarditis autoantibod- ies against several peptides (adenosine nucleotide translocase, cardiac myosin, cardiac troponin) were virtually undetectable. In this study for the first time a multiparametric ELISA for autoimmune antibodies in car- diomyopathy has been developed. There were short peptide sequences of total proteins selected as myocardial antigens. Therefore, it was only possible to detect autoantibodies to these defined peptides. The multiplex ELISA shown here represents an important element for future diagnosis of cardiac autoimmune diseases.