Lokalisation, proteolytische Umwandlung von CALEB und seine Funktion bei der Reifung neuronaler Verschaltungen

Abstract

Zur Charakterisierung der molekularen Vorgänge bei der Bildung und Regulation synaptischer Verbindungen wurde in der Arbeitsgruppe Rathjen das Zelloberflächenprotein CALEB identifiziert. CALEB ist ein Transmembranprotein, das auf der extrazellulären Seite eine charakteristische EGF-ähnliche Domäne enthält. Ziel der Doktorarbeit war es, die genaue Expression in verschiedenen Hirngeweben, die subzelluläre Lokalisation, die proteolytische Umwandlung und die zellbiologischen Funktionen von CALEB zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass CALEB auf das zentrale Nervensystem beschränkt ist und im peripheren Nervensystem nicht vorkommt. Interessanterweise wird CALEB in verschiedenen Formen exprimiert. Während Perioden der Synaptogenese ist CALEB in einigen Hirngeweben zunächst stark glykosyliert und in späteren Stadien nur wenig oder gar nicht glykosyliert. Während der Entwicklung der Maus hat CALEB in einigen Hirngeweben eine maximale Expression zwischen dem 10. und 20. postnatalen Tag. Danach nimmt die Expression ab, besteht aber im adulten Nervensystem fort. Mittels biochemischer und immunzytochemischer Methoden kann gezeigt werden, dass CALEB nicht auf Synapsen beschränkt ist, sondern vorwiegend eine somato-dendritische Lokalisation aufweist. Axone sind negativ für CALEB. In biochemischen Fraktionierungen wie PSD-, Vesikel- oder „Lipid-Raft“-Präparationen verhält sich CALEB wie ein typisches Transmembranprotein, dass sich in der Synaptosomenfraktion anreichert. In der Analyse des Dendritenbaumes nach 4, 8 und 14 Tagen in vitro von sowohl Hippocampus- als auch Kortex-Neuronen konnte in CALEB-defizienten Neuronen eine signifikant verringerte Komplexität im Vergleich zu Wildtyp Neuronen beobachtet werden. Hingegen konnte kein Unterschied in der Anzahl von GABA- ergen und glutamatergen Synapsen mittels Immunfärbungen in der kortikalen Wildtyp und CALEB-defizienten Kultur festgestellt werden. Parallel durchgeführte elektrophysiologische Untersuchungen zeigen jedoch eine Veränderung in der synaptischen Transmission, was durch eine veränderte Morphologie der CALEB-defizienten kortikalen Kulturen erklärt werden könnte. Die Umwandlung von CALEB, von einer Vorläuferform in eine verkürzte Form, wurde sowohl beim Huhn als auch bei der Maus nachgewiesen (Jüttner et al., 2005). Um die Umwandlung von CALEB zu erklären, wurde an akuten, kortikalen Hirnschnitten ein neues Versuchmodell etabliert. Die Western Blotting Analysen zeigen, dass die Umwandlung von CALEB Ca2+ - und zeitabhängig ist und eine Cystein/Serin-Protease erforderlich macht, wobei die Hemmung von Glutamat- NMDA-Rezeptoren die Prozessierung von CALEB in eine kurze membranständige Form vermindert. Phosphorylierung ist ein entscheidender Schritt in der Signaltransduktion und spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von vielen zellulären Prozessen. Aus diesem Grund wurden die potentiellen Phosphorylierungsstellen von CALEB mittels Phosphomotiv-Antikörper analysiert. Eine Phosphorylierung von CALEB konnte mittels Akt oder PKC Phosphomotiv- Antikörpern nicht nachgewiesen werden. Ausgehend von früher durchgeführten mRNA-Expressionsanalysen (Affymetrix-Gene-Chip-Analyse im Colliculus superior von Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu CALEB Knockout-Mäusen) führte ich eine „real-time-PCR“-Analyse von einer Reihe veränderter Kandidatengene durch. Unter ihnen sind insbesondere Untereinheiten spannungsabhängiger Calciumkanäle und die AP2-associated-kinase 1 von Interesse, da sie in Ihrer Expression in der CALEB-defizienten Mäusen vermindert erscheinen. Mit der „real-time-PCR“ konnte jedoch kein signifikanter Unterschied für die mRNA Expression dieser Gene zwischen Wildtyp und Knock-out gefunden werden. Zusammenfassend weisen das Expressionsprofil, sowie die Lokalisation von CALEB und die veränderte neuronale Morphologie in Abwesenheit von CALEB darauf hin, dass CALEB eine Funktion bei der Entwicklung von neuronalen Verschaltungen ausübt.

In order to characterize the molecular components which affect the formation and regulation of synaptic connections, Rathjen´s group identified a transmembrane protein termed CALEB. CALEB is a transmambrane protein containing a characteristic EGF-like domain close to its plasma membrane spanning region suggesting that it is a member of the EGF family of differentiation factors. The aims of this work were to analyse the specific expression of CALEB in different brain tissues, its subcellular localisation, processing, as well as its cellular function. This work shows for the first time that CALEB is restricted to the central nervous system and it is not present in the peripheral nervous system. Interestingly, during early phases of development CALEB is highly glycosylated in specific brain regions, while this posttranslational modification is reduced at later stages. CALEB expression differs between brain regions, reaching a maximum between postnatal days 10 and 20. Its expression can also be seen in the adult nervous system. By using biochemical and immuncytochemical methods I reveal a somato- dendritical localisation of CALEB. It is not restricted to synapses nor is it present on axons. In biochemical fractionations such as PSD, vesicle or lipid rafts preparations CALEB behaves as typical transmembrane protein and is especially rich in the synaptosonal fractions. Analysis of the dendritic tree morphology of cultivated neurons revealed a significant reduction in dendritic tree complexity after 4, 8 and 14 days in culture in the absence of CALEB. This difference was observed both in hippocampal and cortical neuron culture. Immunostaining experiments performed in cortical cultures show that the absence of CALEB does not influence the number of GABAergic and glutamatergic synapses when compared with wild type controls. In this respect, it is interesting to mention that parallel electrophysiological studies from our laboratory showed a change in the synaptic transmission. In an attempt to study the conversion of CALEB, a new assay was developed, which allowed us to use acute mouse brain cortical slices instead of previously used cell cultures (Jüttner et al., 2005). Our experiments show that CALEB processing is time and Ca2+ dependent. Blocking of the NMDA glutamate receptors impairs the proteolytic processing of CALEB. Most probably, the processing of CALEB involves serine and/or cysteine proteases. Potential phosphorylation sites of CALEB were analyzed by Akt and PKC specific phospho-motif antibodies by which no phosphorylation of CALEB could be observed. It has been shown that the absence of CALEB during postnatal development impairs synaptic function (Jüttner et al., 2005). To further investigate which molecules might be affected by CALEB deficiency, a series of candidate genes previously shown to be changed in the Affymetrix gene chip analysis were tested by using real time PCR. The selected genes (different voltage-dependent calcium channel subunits, AP2 associated kinase 1, etc) showed no difference between wild type and CALEB deficient mice. In summary, the developmentally regulated expression pattern and localization of CALEB as well the neuronal morphology in the absence of CALEB suggest that CALEB is implicated in the development, especially during early phases of synaptogenesis.