dc.contributor.author
Wolf, Annette
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:10:39Z
dc.date.available
2015-06-03T12:55:29.559Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/689
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4891
dc.description
Danksagung 4 Inhaltsverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis 8
Abbildungsverzeichnis 12 Tabellenverzeichnis 15 1\. Einleitung 16 1.1 Die B
-Zell-Entwicklung 16 1.1.1 Die Keimzentrumsreaktion 17 1.2 B-Zell-
Differenzierung und Lymphomagenese 20 1.3 Diffuse großzellige B-Zell-Lymphome
22 1.4 GCB DLBCL 23 1.5 ABC DLBCL 24 1.5.1 Aktivierung des NF-κB-Signalwegs 24
1.5.2 Läsionen und Mutationen des NF-κB-Signalwegs bei ABC DLBCL 26 1.5.3
Amplifikation des NFATc1 Genlokus bei ABC DLBCL 28 1.6 Die Familie der NFAT
Transkriptionsfaktoren 29 1.6.1 Strukturelle Merkmale von NFATc1 29 1.6.2
Aktivierung von NFATc1 über den Ca2+-Calcineurin-NFAT-Signalweg 31 1.7
Zielsetzung der Arbeit 34 2\. Material und Methoden 35 2.1 Material 35 2.1.1
Antikörper 35 2.1.2 Antibiotika und Inhibitoren 35 2.1.3 Chemikalien und
Reagenzien 35 2.1.4 Enzyme 37 2.1.5 Geräte 37 2.1.6 Kits 38 2.1.7 qPCR Sonden
38 2.1.8 Verbrauchsmaterialien 38 2.1.9 Zellkulturmedien, -lösungen und
-zusätze 39 2.1.10 Zelllinien und Kulturbedingungen 40 2.1.11 Puffer und
Medien 40 2.1.12 Vektoren und Oligonukleotide 41 2.2 Molekularbiologische
Methoden 42 2.2.1 Design und Klonierung von shRNA-Konstrukten 42 2.2.2
Transformation kompetenter E. coli Bakterien 43 2.2.3 PCR zur Identifikation
shRNA-Konstrukt-positiver Bakterienkolonien und Visualisierung mittels
Gelelektrophorese 43 2.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Bakterien 44
2.2.5 RNA-Extraktion aus DLBCL Zelllinien 45 2.2.6 Herstellung von cDNA 45
2.2.7 qPCR mittels TaqMan® Gene Expression Assays 45 2.2.8 Isolierung
genomischer DNA 45 2.3 aCGH Analysen 46 2.4 Genexpressionsanalysen nach
NFATc1-Herunterregulation bei HBL-1 46 2.5 Retrovirale Transduktion und
zellbiologische Untersuchungen 48 2.5.1 Retrovirale Transduktion von DLBCL
Zelllinien 48 2.5.2 Selektionierung und Ficoll-Trennung von Zellen 50 2.5.3
Doxycyclin-vermittelte Induktion der shRNA-Expression 50 2.5.4 shRNA-
Toxizitätstest 51 2.6 Durchflusszytometrische Analysen 51 2.6.1 Messung und
Analyse von transduzierten DLBCL Zellen 51 2.6.2 Messung der Apoptose bei
HBL-1 52 2.6.3 Messung der HLA-DR Oberflächenexpression bei HBL-1 52 2.7 Zell-
Viabilitätstest mit CsA 52 2.8 Proteinbiochemische Untersuchungen 53 2.8.1
Zelllyse und Bestimmung der Proteinkonzentration 53 2.8.2 Elektrophoretische
Auftrennung von Proteinen 53 2.8.3 Western Blotting 54 2.8.4 Immundetektion 54
3\. Ergebnisse 55 3.1 NFATc1-Expression bei DLBCL Zelllinien 55 3.2 ABC DLBCL
Zelllinien weisen eine 18q Amplifikation auf 56 3.3 NFATc1-Induktion durch
chronische Aktivierung des BZR-Signalwegs 58 3.4 Identifikation spezifischer
shRNAs gegen NFATc1 59 3.4.1 Zwei shRNAs bewirken eine spezifische
Herunterregulation von NFATc1 62 3.5 Die Herunterregulation von NFATc1 hat
einen toxischen Effekt auf zwei der getesteten ABC DLBCL Zelllinien 65 3.6 Die
pharmakologische Inhibierung von Calcineurin ist toxisch für NFATc1-abhängige
ABC DLBCL Zelllinien 67 3.7 Die Herunterregulation von NFATc1 induziert
Apoptose bei HBL-1 69 3.8 Der toxische Effekt ist kein Ergebnis einer NFATc1
shRNA-vermittelten Herunterregulation des Onkoproteins MYC 70 3.9 NFATc1 hat
globalen Einfluss auf die Genexpression 73 3.9.1 Herstellung von Arrayproben
durch shRNA-vermittelte NFATc1-Herunterregulation bei HBL-1 73 3.9.2
Genexpressionsanalysen NFATc1-regulierter Gene 74 3.9.3 Gene Set Enrichment
Ananlysis (GSEA) der NFATc1 shRNA Down- und Up-Eigensignaturen 76 3.10 NFATc1
moduliert den NF-κB-Signalweg 79 3.11 NFATc1 dereguliert die Expression von
MHC Klasse II-Molekülen 81 3.11.1 Differenzielle MHC Klasse II-
Molekülexpression nach NFATc1-Herunterregulation mit zwei verschiedenen NFATc1
shRNAs 82 3.11.2 Modulierung der MHC Klasse II-Molekülexpression durch die
pharmakologische Inhibierung von Calcineurin 84 4\. Diskussion 86 4.1 DLBCL
Zelllinien sind ein geeignetes Modell für die Untersuchung der Rolle von
NFATc1 bei der molekularen Pathogenese von DLBCL 86 4.2 Zwei shRNAs induzieren
eine Herunterregulation von NFATc1 88 4.3 NFATc1 ist essenziell für zwei ABC
DLBCL Zelllinien 90 4.4 NFATc1 reguliert die Expression pro proliferativer und
anti apoptotischer Faktoren 92 4.5 NFATc1 moduliert den NF-κB-Signalweg und
die Aktivierung von STAT3 95 4.6 Regulation der MHC Klasse II-
Molekülexpression durch NFATc1 – mögliche Rolle im Immune Escape 98 4.7 Fazit
und Ausblick 102 5\. Zusammenfassung 104 6\. Summary 105 7\.
Literaturverzeichnis 106 8\. Publikationen 123 9\. Eidesstattliche Erklärung
124 10\. Anhang 125
dc.description.abstract
Diffuse großzellige B-Zell-Lymphome (DLBCL) sind aggressive Neoplasien reifer
B-Zellen und repräsentieren die häufigsten neu diagnostizierten Lymphome.
Genexpressionsanalysen gelang die Differenzierung der heterogenen DLBCL in
mindestens zwei vorherrschende molekulare Subtypen, mit einem
Expressionsprofil ähnlich dem von Keimzentrums-B-Zellen (GCB DLBCL) oder
aktivierten Post-Keimzentrums-B-Zellen (ABC DLBCL). Ein charakteristisches
Merkmal der ABC DLBCL ist ihre Abhängigkeit von der konstitutiven Aktivierung
des NF κB-Signalwegs. Zudem tragen ca. 40% der ABC DLBCL Fälle einen
Hinzugewinn des Chromosomenabschnitts 18q, auf dem u.a. der
Transkriptionsfaktor NFATc1 (Nuclear Factor of Activated T cells c1) codiert
und dadurch stärker exprimiert wird. Die gesteigerte Expression und Aktivität
von NFATc1 konnte bereits mit der Pathogenese verschiedener Tumorerkrankungen
in Verbindung gebracht werden. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit am
Zellkulturmodell untersucht werden, ob NFATc1 auch an der molekularen
Pathogenese der DLBCL beteiligt ist. Bei zwei ABC DLBCL Zelllinien (HBL-1 und
TMD8) konnte eine konstitutive Aktivierung von NFATc1 beobachtet werden, die
wahrscheinlich durch den chronisch aktiven B-Zell-Rezeptor-Signalweg
aufrechterhalten wird. Sowohl die pharmakologische Inhibierung der
NFATc1-aktivierenden Phosphatase Calcineurin als auch die shRNA-vermittelte
Herunterregulation von NFATc1 hatten auf beide Zelllinien einen selektiven
toxischen Effekt. Dieser beruhte auf einer Induktion der Apoptose und
bekräftigte somit die Abhängigkeit dieser DLBCL Zelllinien von der
NFATc1-Aktivität. Genexpressionsanalysen nach shRNA-vermittelter
Herunterregulation von NFATc1 ermöglichten die Identifikation pro-
proliferativer und anti-apoptotischer Faktoren, deren Expression durch NFATc1
reguliert wird. Darüber hinaus scheint NFATc1 an der Signalweiterleitung über
den NF κB-Signalweg beteiligt zu sein und moduliert die Expression bekannter
NF κB-Zielgene. Dies deutet auf eine synergistische Funktion beider
Transkriptionsfaktoren bei der Pathogenese der ABC DLBCL. Weiterhin wurde die
Phosphorylierung von STAT3, die einigen ABC DLBCL Zelllinien die
Eigenversorgung mit autokrinen Wachstumsfaktoren ermöglicht, nach
Herunterregulation von NFATc1 inhibiert. Schließlich konnte eine unterdrückte
Expression von MHC Klasse II-Molekülen durch NFATc1 beobachtet werden. Sowohl
die Herunterregulation von NFATc1 als auch die pharmakologische Inhibierung
von Calcineurin mittels Cyclosporin A induzierten die MHC Klasse II-
Molekülexpression, was eine Beteiligung von NFATc1 am Entfliehen vor der
Erkennung und Eliminierung durch das Immunsystem (Immune Escape) suggeriert.
Zusammenfassend weisen die hier gewonnenen Erkenntnisse darauf hin, dass
NFATc1 eine unterstützende bzw. onkogene Rolle bei der molekularen Pathogenese
einer Subgruppe der DLBCL einnimmt, die therapeutisch genutzt werden könnte.
de
dc.description.abstract
Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a mature B-cell neoplasm and
represents the most frequent lymphoma subtype in adults. Gene expression
profiling enabled the differentiation of the heterogeneous diagnostic category
into two predominant DLBCL subgroups that arise from distinct stages of B-cell
differentiation: the germinal center B-cell-like (GCB) and the activated B
-cell-like (ABC) DLBCL. ABC DLBCLs are characterized by a constitutively
active NF κB signaling pathway. Furthermore, approximately 40% of all ABC DLBC
cases harbor a gain or amplification of the 18q chromosome arm, which causes
an enhanced expression of 18q encoded genes like the NFATc1 (Nuclear Factor of
Activated T cells c1) transcription factor. The increased expression and
activation of NFATc1 were shown to be implicated in the pathogenesis of
different types of cancer. Therefore, the aim of this study was to investigate
whether NFATc1 is also involved in the molecular pathogenesis of DLBCL using a
DLBCL cell culture model. NFATc1 was constitutively active in two ABC DLBCL
cell lines (HBL-1 and TMD8) presumably due to the chronic activation of the B
-cell-receptor signaling pathway in these cell lines. Both the pharmacological
inhibition of the NFATc1-activating phosphatase Calcineurin as well as the
shRNA-mediated knockdown of NFATc1 had a selective toxic effect for HBL-1 and
TMD8. The toxicity resulted from an increased induction of apoptosis and
underlined the addiction of the cell lines to the transcriptionally active
NFATc1 protein. Using gene expression profiling upon shRNA-mediated NFATc1
knockdown, pro-proliferative and anti-apoptotic factors were identified to be
transcriptionally regulated by NFATc1. Furthermore, NFATc1 was shown to induce
the NF κB signaling pathway and the expression of NF κB target genes
suggesting a synergistic role for both transcription factors in the
pathogenesis of ABC DLBCLs. NFATc1 knockdown resulted in a reduced
phosphorylation of STAT3 that is needed for the autonomous supply of autocrine
growth and survival factors in some ABC DLBCLs. Finally, NFATc1 was shown to
suppress the MHC class II-molecule expression in the ABC DLBCL cell line
HBL-1. The knockdown of NFATc1 as well as the inhibition of Calcineurin using
Cyclosporin A released the expression of MHC class II-molecules indicating an
involvement of NFATc1 in the circumvention of the identification and
elimination of the malignant cell by the immune system (immune escape). Taking
all into account, the herein made observations suggest a supporting, in
particular, an oncogenic role of NFATc1 in the pathogenesis of a subgroup of
DLBCLs that might be targeted therapeutically.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
B-Zell-Lymphome
dc.subject
Genexpressionsanalysen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Die Rolle von NFATc1 bei der molekularen Pathogenese von diffusen großzelligen
B-Zell-Lymphomen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Georg Lenz
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2015-04-22
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000099371-3
dc.title.translated
The role of NFATc1 in the molecular pathogenesis of diffuse large B-cell
lymphoma
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000099371
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000017142
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open access