Oligomerisierung, Metallbindungseigenschaften und Funktion der beta‐Sekretase BACE1

Abstract

Das „β-Site APP-Cleaving Enzyme 1“ (BACE1) ist eine membranständige Aspartat- Protease mit einer proteolytisch aktiven Ektodomäne, einer Transmembransequenz und einem kurzen zytosolischen Teil. Unter den bekannten BACE1-Substraten befindet sich das Amyloid Precursor Protein (APP). Die APP-Spaltung durch BACE1 ist der erste Schritt einer sequenziellen Prozessierung, welche letztlich zur Freisetzung des Aβ-Peptids führt. Da das neurotoxische Aβ42-Peptid der Hauptverursacher der Alzheimer-Krankheit ist, stellt die Inhibition der β-Sekretase BACE1 eine der vielversprechendsten therapeutischen Strategien zur Prävention oder Bekämpfung der Alzheimer-Krankheit dar. Der Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit war die Tatsache, dass zwar der grundlegende β-sekretorische Spaltungsmechanismus von APP durch BACE1 bekannt war, jedoch nicht dessen Feinregulation auf Proteinebene. Insbesondere sollte die mögliche Bedeutung der gelelektrophoretisch bereits gezeigten Homodimerisierung für die Aktivität, Lokalisation, Stabilität oder Substraterkennung aufgeklärt werden. Darüber hinaus war das Ziel, die Rolle der bereits bekannten Kupferbindungsstellen in der Ektodomäne und im zytosolischen Teil für die β-Sekretase-Aktivität und einen potenziellen Zusammenhang zwischen Metallbindung und Oligomerisierung zu untersuchen. Mit Hilfe von FLIM-FRET, einer mikroskopbasierten Technik zur Messung von Protein- Protein-Interaktion, konnte erstmalig die Homodimerisierung von BACE1 in lebenden Zellen gemessen werden, was darauf hindeutete, dass BACE1-Dimer eine Relevanz in vivo haben könnten. Nach Behandlung von BACE1-transfizierten Zellen mit Cu(II) konnte per Western Blot die konzentrationsabhängige Stabilisierung von SDS- und reduktions-stabilen BACE1-Dimeren sowie, unter nicht-reduzierenden Bedingungen, BACE1-Tetrameren beobachtet werden. Mittels Mutationsanalyse wurde die kupfervermittelte Kreuzvernetzung von BACE1-Oligomeren auf den Cys466-Rest in der Transmembransequenz (TMS) von BACE1 zurückgeführt, welcher sich in dem metallbindungsstellenähnlichen M462xxxC466xxxM470xxxC474-Motiv befindet. Die metallvermittelte Kreuzvernetzung von SDS-stabilen Dimeren ließ sich ebenfalls mit dem Cu(II)-Analogon Pd(II) und dem Thiophil Hg(II) durchführen. Der Effekt der Kupferbehandlung konnte allerdings am besten mit dem redox-inerten Cu(I)-Analogon Ag(I) nachgestellt werden, wobei hier keine reduktions-stabilen Dimer, sondern nur SDS-stabile Dimere und Tetramere erhalten werden konnten. Es ergeben sich folgende Schlussfolgerungen: (1) Der kupfervermittelten Kreuzvernetzung geht eine Reduktion von Cu(II) zu Cu(I) voraus. (2) Die BACE1-Transmembransequenzen im Dimer/Tetramer bilden eine Metallbindungsstelle aus, deren wichtigster Bestandteil Cys466 darstellt, und die ihre höchste Affinität bei Bindung von Cu(I) entfaltet. (3) Die Stabilisierung von Tetrameren durch Cu(I) und Ag(I) findet wahrscheinlich unter Beteiligung von d10-d10-Wechselwirkungen (Closed-Shell Complex) der Metalle statt. Die kupfervermittelte Kreuzvernetzung konnte in der Folge eingesetzt werden, um den Einfluss der BACE1-Dimerisierung auf die APP-Spaltung zu untersuchen. Ein zellbasierter Aktivitätstest offenbarte, dass die kupfervermittelte Kreuzvernetzung von BACE1 die β-sekretorische APP-Spaltung erhöht, was auf eine Erhöhung der Spaltungseffizienz von dimerem APP durch dimeres BACE1 zurückzuführen sein könnte. Mit diesem Ansatz konnte erstmalig ein Aktivitätsvergleich zwischen freiem BACE1, welches vermutlich in einem dynamischen Gleichgewicht zwischen monomerem und oligomerem Zustand steht, und fest verbundenen Oligomeren, angestellt werden. Dabei zeigte sich ein direkter Zusammenhang zwischen der BACE1-Oligomerstabilisierung und der APP-Spaltung, was die Störung der Dimerisierung/Oligomerisierung zu einem neuen therapeutischen Ziel macht. Neben der Metallbindung der TMS wurde nach weiteren Interaktionsmotiven gesucht, was zur Identifizierung des A459xxxA463xxxA467-Motivs führte. Dieses Motiv, welches mit dem M462xxxC466xxxM470-Motiv interkaliert vorliegt, ist typisch für Helix-Helix- Interaktionen innerhalb der Membran und diente als Basis zur Berechnung eines möglichen Strukturmodells des BACE1-TMS-Dimers. Die Tatsache, dass BACE1 sowohl mit der Ektodomäne als auch innerhalb der TMS und im Zytosol Kupferionen binden kann, führte zu der Hypothese, dass BACE1 eine Funktion in der zellulären Kupferhomöostase übernimmt oder durch Kupfer reguliert wird. Ein Indiz für eine mögliche Rolle im Kupferstoffwechsel lieferte das in vivo- Modell D.melanogaster. Es konnte gezeigt werden, dass unter Kupfermangelbedingungen Fliegen mit einem Ctr1B -/- Hintergrund nur überlebten, wenn sie als Transgen humanes BACE1 exprimierten. Dies war ein deutliches Indiz dafür, dass BACE1 direkt oder indirekt die Kupferaufnahme der Fliegen stimulieren konnte. Des Weiteren wurde einer möglichen Funktion von BACE1 beim Abbau von Aβ nachgegangen. Durch einen in vitro-Verdau mit BACE1 und MALDI-MS konnte eine neue Spaltstelle im Aβ C-terminal von Q15 identifiziert werden. Außerdem zeigte sich im Zellkultursystem, dass der Abbau von Aβ durch BACE1 offenbar nur stattfindet, solange das Aβ-Peptid sich nach der Freisetzung durch die γ-Sekretase noch in Membrannähe befindet bzw. membranassoziiert vorliegt. Zusammengefasst eröffnen die gezeigten Befunde eine neue Sichtweise auf die Struktur und Funktion der β-Sekretase BACE1, die offenbar mehr ist als ein Typ I-Membranprotein mit einer proteolytisch aktiven Ektodomäne. Stattdessen kann BACE1 als oligomerer, dynamischer Komplex mit einer funktionellen und interagierenden Transmembransequenz verstanden werden, der neben der APP-Spaltung (Aβ-Produktion) auch am Abbau von Aβ beteiligt sein könnte. Zusätzlich zur proteolytischen Aktivität bindet der Komplex Metallionen und könnte eine Rolle im Kupferstoffwechsel einnehmen.

The “β-site APP-cleaving enzyme 1” (BACE1) is an aspartic acid protease with its catalytic activity in the ectodomain, a single transmembrane helix, and a short cytosolic part. Among the known BACE1 substrates is the Amyloid Precursor Protein (APP). The cleavage of APP by BACE1 is the first step of a sequential processing eventually leading to the release of the Aβ peptide, of which the neurotoxic Aβ42 is the major cause of Alzheimer’s disease (AD). Hence, the inhibition of the β-secretase BACE1 is one of the most promising therapeutic strategies to prevent or treat AD. The starting point of this work was to examine the regulation of β-secretory activity of BACE1 on the protein level, since the principal mechanism of APP cleavage was known, but not the fine tuning. This especially included the putative influence of BACE1 homodimerization on activity, localization, stability, or substrate recognition. Furthermore, the objective was to define a role for the known copper-binding sites in the ectodomain and the cytosolic part and to elucidate a potential interrelation between metal binding and oligomerization. By applying FLIM-FRET, a microscope-based technique used to measure protein–protein interactions, BACE1 homodimerization could be demonstrated in living cells for the first time. This finding is a strong indicator that the BACE1 dimer, which previously only has been shown by gel-electrophoretic methods, has relevance in vivo. The treatment of BACE1-transfected cells with Cu(II) led to the concentration-dependent stabilization of SDS- and reduction- stable dimers as demonstrated by Western blotting. Under non-reducing conditions these dimers were accompanied by BACE1 tetramer bands. This copper- mediated crosslink could be assigned to Cys466, which is part of the M462xxxC466xxxM470xxxC474-motif within the transmembrane sequence (TMS) of BACE1, by using mutational analysis. The metal-mediated crosslink of SDS- stable dimers also worked with the Cu(II)-analog Pd(II) and the thiophile Hg(II). However, the effect of copper could be mimicked best by treating the cells with Ag(I), with the limitation that only SDS-stable dimers and tetramers and no reduction-stable dimers could be observed. The following conclusions can be drawn: (1) The copper-mediated crosslink is preceded by a reduction of Cu(II) to Cu(I). (2) The BACE1 transmembrane-sequences of a dimer/tetramer build a metal-binding site with Cys466 as its most important part and with the highest affinity towards Cu(I). (3) The stabilization of tetramers by Cu(I) and Ag(I) most probably involves d10-d10 interactions (closed-shell complex) of the metals. The copper-mediated crosslink was then used to evaluate the influence of BACE1 dimerization on APP cleavage. By establishing a cell-based activity assay, it could be revealed that crosslinked BACE1 oligomers exhibited an elevated APP processing. The reason could be a higher cleavage efficiency due to dimeric APP being confronted with dimeric BACE1, with the latter not able to shift freely between monomeric and oligomeric state anymore. This finding correlates BACE1-oligomer stabilization with APP cleavage and therefore suggests interference with dimerization/oligomerization as a novel therapeutic strategy. Besides the metal-binding properties of the BACE1-TMS, the A459xxxA463xxxA467-motif, which is typical for helix–helix interactions, could be identified. It is intercalated with the M462xxxC466xxxM470-motif and served as the basis to calculate a structural model of the BACE1-TMS dimer. Due to the fact that BACE1 possesses copper-binding site in the ectodomain, in its TMS, and in its cytosolic part, a potential involvement of BACE1 in the cellular copper homeostasis was examined by creating transgenic D.melanogaster which expressed human BACE1. Under copper-starvation conditions flies with an Ctr1B -/- background could only survive if they expressed BACE1. This was a clear indication that BACE1 directly or indirectly stimulated copper uptake in these flies. Furthermore, the potential role of BACE1 for Aβ clearance was adressed by performing an in vitro-proteolysis and establishing a cell-culture system. MALDI MS measurements after in vitro-proteolysis revealed an additional cleavage site of BACE1 within the Aβ sequence C-terminally of Q15. The results from the cell-culture system suggested that Aβ degradation by BACE1 will only take place as long as Aβ is still membrane-associated after release by γ-secretase cleavage. Taken together, this work offers a new perspective on the structure and function of the β-secretase BACE1, since it demonstrates BACE1 to be more than just a type I-transmembrane protein with a proteolytically active ectodomain. Instead, BACE1 can be perceived as an oligomeric, dynamic complex with a functional and interactive TMS which could, in addition to its role in APP processing (Aβ production), be involved in Aβ clearance. Moreover, the complex binds metal ions and could take part in the copper homeostasis.