Structure-optimized ProM scaffolds address Ena/VASP as a possible antimetastatic target

Abstract

Metastasis is the major lethal attribute of cancer. However, the lack of antimetastatic drugs and the limited progress of metastasis-directed drug development efforts make new approaches essential in drug design. Despite being a marker of breast carcinogenesis and signature of invasive cancer progression, potent inhibitors against the actin regulatory protein family Ena/VASP remained elusive. Recently, we showed that interfering with Ena/VASP causes significant reduction in breast cancer cell invasion. We designed and evaluated diproline mimicking scaffolds, coined ProM, to inhibit the proline- mediated protein-protein interaction of the Ena/VASP EVH1 domains with a non- toxic, selective and cell-membrane-permeable inhibitor. However, the moderate affinity of the initial inhibitor will restrict the validation in future animal studies. In this work, we optimize the affinity of this inhibitor by using structural informations of 16 Ena/VASP EVH1 crystal structures. We solve the binding mode of the elongated peptide of the actin assembly-inducing protein (ActA) of Listeria monocytogenes. We mimic the found interactions of ActA with new scaffolds and develop a 734 Da compound with nanomolar affinity, which serves as novel starting point for in vivo studies. We conserved the structural simplicity, low-molecular weight and pharmacological properties of the inhibitor while drastically increasing the affinity of the scaffolds against the flat protein surface. The herein presented structure-affinity relationship study demonstrates the powerful modular architecture of our scaffold toolbox and paves the way for future in vivo studies. Structure- optimized ProM scaffolds might represent a novel class of antimetastatic drugs acting at the very end of converging receptor kinase signaling and integrin pathways.

Metastasen sind die häufigste Todesursache der Krebserkrankung. Neue Arzneimittel erreichen jedoch häufig nicht ausreichende Steigerung der Überlebensrate von Patienten und die medikamentösen Tumortherapien zeigen nur geringen Erfolg. Es gibt daher grossen Bedarf an neuen Ansätzen. Obwohl die Aktin-Regulatoren der Ena/VASP Proteinfamilie als Marker für Karzinogenese der Brust und als Signatur invasiver Krebsentwicklung gelten, gab es bislang keine zellgängigen Inhibitoren gegen diese Proteine. Wir haben kürzlich gezeigt, dass eine Interferenz mit Ena/VASP die Invasivität von Brustkrebszellen signifikant reduziert. Dazu haben wir di-Prolin-Mimetika entwickelt, genannt ProM, welche die prolinvermittelte Protein-Protein Interaktion der Ena/VASP EVH1-Domäne nachahmen. Aufbauend auf der Verknüpfung zweier ProM Bausteine konnten wir einen nicht toxischen, selektiven und zellgängingen Inhibitor entwickeln, der Ena/VASP erfolgreich von seinen natürlichen Interaktionspartnern verdrängt. Die moderate Bindungsstärke dieses Inhibitors wird jedoch die Validierung in zukünftigen Tierexperimenten erschweren. In dieser Arbeit wird die Affinität des Inhibitors mit Hilfe struktureller Informationen aus 16 Ena/VASP-EVH1 Kristallstrukturen optimiert. Dabei entschlüsseln wir den Bindungsmodus der C-terminal verlängerten Bindesequenz des Proteins ActA von Listeria monocytogenes. Wir ahmen die gefundenen Interaktionen von ActA mit neuen ProM Bausteinen nach und entwickeln einen 734 Da Inhibitor, der als neuer Ausgangspunkt für in vivo Studien verwendet werden kann. Wir konservierten dabei die strukturelle Einfachheit, das kleine Molekulargewicht und pharmakologischen Eigenschaften des Inhibitors und erhöhten die Bindungsstärke der ProM Scaffolds gegen ein flaches Epitop drastisch. Die hier präsentierte Struktur-Affinitäts-Beziehung demonstriert die Vorteile der modular aufgebauten ProM Moleküle und ebnet den Weg für zukünftige in vivo Studien. Die strukturoptimierten ProMs könnten eine neue Klasse von Medikamenten in der Tumortherapie darstellen, die ihre Wirkung am Ende der Rezeptor Tyrosinkinasen und Integrin Signalkaskaden entfalten.