Generierung und Evaluierung von hochspezifischen Zinkfinger-Nukleasen

Abstract

Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), welche als chimäre Proteine aus einer hochspezifischen Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne (ZF-DBD) und einer unspezifischen, nur als Dimer aktiven FokI-Nukleasedomäne bestehen, stellen ein sehr effizientes Werkzeug für das gezielte Einfügen eines Doppelstrangbruches (DSB) in jede DNA-Sequenz einer Zelle dar. Die ZF-DBD setzen sich aus einzelnen Zinkfinger (ZF)-Modulen zusammen, wobei jeweils ein Modul an drei Basen innerhalb der gewünschten ZF-Bindungsstelle bindet. So können ZFN sowohl zur gezielten Mutagenese von Genen als auch, in Anwesenheit einer zum geschädigten DNA-Lokus homologen Donor-DNA, zur DSB-induzierten Stimulation des Gentargetings angewandt werden. Das Ziel der Doktorarbeit war der Vergleich zweier bestehender sowie die Entwicklung einer neuen, auf Semliki-Forest-Viren (SFV) basierenden Plattform zur Generierung und Selektion von ZFN. Ausgehend von einer modularen Architektur der ZF-DBD stand am Anfang der Doktorarbeit die Etablierung eines PCR-basierten (polymerase chain reaction) Gensynthesesystems zum Zusammenfügen einzelner ZF-Module mit bekannten DNA-Bindungseigenschaften (modular assembly). Dabei erwies sich das PCR-System hinsichtlich seiner Fehleranfälligkeit als sehr zuverlässig. Allerdings ergaben umfangreiche funktionelle Tests in Bakterien und humanen Zelllinien, dass die Erfolgsrate, mit modular assemblierten, aus drei Modulen bestehenden ZF-DBD funktionelle ZFN-Paare zu generieren, lediglich 3% beträgt. Modular assembly scheint deshalb für die Generierung funktioneller ZFN nicht geeignet zu sein, da einzelne Module innerhalb einer ZF-DBD nicht unabhängig voneinander agieren. Zum Vergleich wurden ZF-DBD mit einem kontext-abhängigen Selektionssystem generiert, in dem die ZF-Module im Kontext ihrer benachbarten Module selektioniert wurden. Die Mehrheit der resultierenden ZFN vermochte hocheffizient genetische Modifikationen in einem chromosomal vorliegenden Reportergen sowie in vier endogenen Loci in humanen bzw. pflanzlichen Zellen herbeizuführen, wobei absolute Gentargetingraten von 1-50% erzielt werden konnten. Darüber hinaus wurde mit der Entwicklung des SFV-Systems begonnen, um ZF-Proteine in Zukunft im eukaryotischen Kontext selektionieren zu können. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass im Rahmen dieser Doktorarbeit essentielle Erkenntnisse bezüglich der Generierung und Evaluierung von ZFN gewonnen wurden, die einen wichtigen Beitrag für zukünftige ZFN-vermittelte Genommodifikationen darstellen.

Zinc finger nucleases (ZFN) are chimeric proteins composed of a highly specific zinc finger DNA-binding domain (ZF-DBD) linked to a non-specific FokI-nuclease cleavage domain that is only active as a dimer. These artificial nucleases are efficient tools for the targeted insertion of a double-strand break (DSB) into any chosen DNA sequence of a cell. A ZF-DBD is composed of three single zinc finger (ZF) modules, each one recognizing three nucleotides within the target site. Hence, ZFN can be used for the targeted mutagenesis of genes and, in the presence of a donor DNA that harbors homologous sequences to the damaged locus, for the stimulation of gene targeting. The aim of this doctoral thesis was the comparison of two existing as well as the establishment of a new Semliki-Forest-Virus (SFV) based platform for the generation and selection of ZFN. Based on the modular architecture of ZF-DBD, the first step was to establish a PCR-based (polymerase chain reaction) system for the synthesis of ZF-DBDs composed of three single ZF modules with known DNA-binding properties (modular assembly). The PCR-based gene synthesis system turned out to be very reliable with regard to error proneness. However, large- scale functional tests in bacteria and human cell lines showed that the success rate for generating functional ZFN pairs made by the modular assembly method was only about 3%. Hence, modular assembly was likely to fail because single ZF modules within a ZF-DBD seem not to act independently. For comparison, ZF-DBDs were constructed with a context-sensitive selection system by selecting individual ZF modules in the context to their neighboring modules. The resulting ZFN were able to induce highly efficient genetic modifications in a chromosomally integrated EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter gene as well as in four endogenous loci in human and plant cells, respectively. The absolute frequencies of gene targeting ranged from 1–50%. In addition, the development of the SFV-based selection system that aims at enabling the selection of ZF proteins in a eukaryotic context in the future was initiated. In conclusion, essential results concerning the generation and evaluation of ZFN could be gained in the framework of this doctoral thesis, which will be important for ZFN-mediated genome modifications in the future.