Identifizierung und Charakterisierung von niedermolekularen Inhibitoren des AKAP -Lbc-vermittelten Guaninnukleotidaustausches von RhoA

Abstract

Das A-kinase Ankerprotein AKAP-Lbc verankert die Proteinkinase A (PKA) und fungiert als Guaninnukleotidaustauschfaktor (GEF) für die kleine GTPase RhoA. AKAP-Lbc vermittelt als Multienzymkomplex die α-Adrenozeptor-(AR-)-induzierte Hypertrophie in Kardiomyozyten. Um die Funktion des AKAP-Lbc/RhoA-Komplexes dabei näher zu charakterisieren, wurde eine Methode entwickelt, die als Hochdurchsatzverfahren zur Suche nach möglichen Inhibitoren der AKAP-Lbc- katalysierten Aktivierung von RhoA verwendet werden kann. Als Grundlage wurde die GEF-Aktivität des AKAP-Lbc, exakter der Nukleotidaustausch von GDP zu GTP von RhoA, genutzt, welcher mittels dem fluoreszenzmarkierten GTP-Analogon 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-Guanosintriphosphat (mGTP) visualisiert wurde. Die für ein High-throughput Screening benötigten Mengen an reinen, aktiven Proteinen wurden rekombinant in Bakterienzellen exprimiert, aus dem Bakterienlysat isoliert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Eine Bibliothek von 18.000 niedermolekularen Substanzen wurde in einem verlässlichen Hochdurchsatzverfahren nach potenziellen Inhibitoren durchsucht. Nach dem Validierungsprozess hemmten drei Substanzen (31413, 31864 und 31892) den Austausch von GDP-RhoA zu GTP-RhoA, und damit die Aktivierung von RhoA in vitro. Die ermittelten IC50-Werte lagen bei 25 µM (31413), 40 µM (31864) und 79 µM (31892). Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit wurden auch bekannte Furocoumarine auf ihre Wirkung auf den AKAP-Lbc-vermittelten Nukleotidaustausches von RhoA untersucht. Keine von diesen Substanzen zeigte im verwendeten Konzentrationsbereich eine Hemmung. Untersuchungen der Verträglichkeit an Zellen wiesen darauf hin, dass die Substanzen in den verwendeten Konzentrationen nicht toxisch waren. Dafür hemmte die Substanz 31413 die Lysophosphatidsäure-induzierte Stressfaserbildung in 3T3-Zellen sowie die Gα12- aber nicht Gαq-vermittelte RhoA-Aktivierung in HEK293-Zellen. Ferner zeigte die Substanz 31413 nur eine Hemmung der AKAP-Lbc-vermittelten, SRE-induzierten Luziferase-Aktivität. Diese Ergebnisse belegten, dass 31413 eine spezifische Hemmung der AKAP-Lbc-vermittelten Rho-Aktivierung hervorruft. Mit Blick auf die Wechselwirkung zwischen AKAP-Lbc und RhoA und deren Beteiligung an der α-adrenerg-induzierten Herzmuskelhypertrophie, wurden Experimente an isolierten, neonatalen Kardiomyozyten angeschlossen. Dabei wurde für die Substanz 31413 eine Hemmung der α-AR-induzierten, nicht jedoch der α-AR-stimulierten Erhöhung der Schlagfrequenz von neonatalen Kardiomyozyten ermittelt. Die Beobachtung, dass 31413 die Adrenalin-induzierte Kontraktion nicht hemmt, ist demnach ein weiterer Beleg für die spezifische Wirkung des Moleküls auf den α-AR-induzierten RhoA-Signalweg. Dies impliziert, dass auch die α-AR-ausgelöste Hypertrophie beeinflusst werden könnte. Damit stellt die identifizierte Substanz ein wegweisendes Werkzeug für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten für Herzhypertrophie und der daraus hervorgehenden Herzinsuffizienz dar.

The A kinase anchoring protein AKAP-Lbc tethers protein kinase A (PKA) and possesses a guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity which stimulates the small GTP-binding protein RhoA. RhoA controls a plethora of cellular processes including gene expression, cellular growth and cytoskeletal dynamics. Pathological changes of its function, in particular with regard to cytoskeletal structures are often responses to chronic stress signals, a common characteristic of many diseases including chronic heart failure. In order to analyse the functional relevance of the AKAP-Lbc/RhoA signalling complex in such processes small molecule inhibitors of the AKAP-Lbc-induced RhoA activation should be identified. AKAP-Lbc catalyzes the exchange of GDP to GTP in RhoA promoting its activation. Thus a nucleotide exchange assay for screening a library of about 18,000 small molecules was established using recombinant proteins and the fluorescently-labelled GTP analogue 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-Guanosintriphosphat (mGTP). Three compounds (31413, 31864 and 31892) were found to inhibit the AKAP-Lbc-mediated nucleotide exchange from GDP-bound RhoA to GTP-bound RhoA and, consequently, RhoA activation in vitro. Measured IC50 values were 25 µM (31413), 40 µM (31864) or 79 µM (31892). Compound 31413 inhibits stress fiber formation induced by lysophosphatidic acid in 3T3 cells. For 31413 an inhibition of Gα12-mediated, but not Gαq-induced activation of RhoA was observed in HEK293 cells. Further, 31413 seemed to specifically inhibit AKAP-Lbc-mediated SRE- induced luciferase activation. These results imply that 31413 specifically blocks AKAP-Lbc-mediated RhoA activation. Bearing in mind the participation of the interaction between AKAP-Lbc and RhoA in the development of cardiac hypertrophy, experiments with isolated neonatal cardiac myocytes were conducted. Compound 31413 inhibits α1-adrenergic increase in beating frequency of isolated neonatal cardiac myocytes. This observation implies that α1-adrenergic induced cardiac hypertrophy may be modulated by the compound. This small molecule represents not only a valuable tool, but may pave the way to novel approaches for the treatment of diseases that involve AKAP-Lbc- mediated activation of RhoA such as chronic heart failure.