Epidemiologische Untersuchung über das Vorkommen der Subtypen A und B des aviären Pneumovirus in Geflügelbeständen in Deutschland

Abstract

Die vorliegende Untersuchung hatte zum Ziel, die aktuelle Verteilung der Subtypen A und B des aviären Pneumovirus (APV) in den Geflügelbetrieben in Deutschland zu ermitteln. Zu Beginn wurde eine nested RT-PCR entwickelt, die diese Subtypen detektieren und unterscheiden kann. Dazu wurden für die erste PCR zwei publizierte Primer verwendet, die in der konservierten Region auf dem Genom des G-Proteins liegen. Ein Primer wurde dafür modifiziert. Für die zweite PCR wurden drei Primer konstruiert, wovon zwei in der hypervariablen Region des G-Proteins liegen und die Subtypen A oder B identifizieren können. Alle untersuchten, bekannten Isolate reagierten positiv mit der nested RT-PCR und konnten eindeutig dem Subtyp A oder B bzw. A und B zugeordnet werden. Um die Spezifität nachzuweisen, wurden unterschiedliche aviäre Viren getestet. Diese zeigten keine positive Reaktion mit der entwickelten PCR. Die Sensitivität der nested RT-PCR wurde mit definierten Mengen Virus in Verdünnungsreihen anhand von zwei Isolaten und zwei Impfstoffen für die beiden Subtypen ermittelt. Die Nachweisgrenze war vergleichbar mit den in der Literatur beschriebenen PCRs. Da die PCR nicht zwischen Impfstamm und Feldstamm unterscheiden kann, wurde ein Versuch zur Bestimmung der Nachweisdauer von Lebendimpfstoff aus Trachealtupfern bei Puten durchgeführt. Dazu wurden einen-Tag-alte Puten mit Subtyp A (Gruppe A), Subtyp B (Gruppe B) oder Subtyp A und B (Gruppe A und B) geimpft und über fünf Wochen Blut- und Trachealtupferproben genommen. Das Impfstoff-Virus wurde bis vier Wochen nach einer einmalig erfolgten Impfung mit Subtyp A oder bis drei Wochen nach einer einmaligen Impfung mit Subtyp B mit der entwickelten RT-PCR nachgewiesen. Bis zum Versuchende nach fünf Wochen war bei einer Impfung mit Subtyp A und B ein Nachweis des Impfstoffes Subtyp A möglich. Die Auswertung der Blutproben mit dem ELISA-Test zeigte ab der zweiten Woche bei Gruppe A und B, ab der dritten Woche bei Gruppe A und ab der vierten Woche bei Gruppe B Antikörpertiter im positiven Bereich. In den untersuchten Betrieben, in denen Puten gehalten wurden, lag die Nachweisrate von RNS des APV bei 68 %. In 73 % der positiven Herden konnte die RNS des Subtyps A nachgewiesen werden. Er war damit der am häufigsten vorkommende Subtyp in Deutschland. Der Nachweis von RNS des Subtyps B gelang in 17 % der Herden und die RNS der Subtypen A und B wurde in 10 % der Putenherden detekiert. Die Betrachtung der RT-PCR-Ergebnisse im Zusammenhang mit dem Alter der Puten ergab einen Anstieg von APV Nachweisen zwischen der 8. und 12. Lebenswoche. In den Herden mit männlichen Puten wurde die RNS des APV häufiger nachgewiesen als bei den weiblichen Tieren. Zudem lag der prozentuale Anteil der Subtyp A positiven Herden bei den männlichen Puten höher als bei den weiblichen.

The aim of this investigation was to find out the spread of subtype A and B of the avian pneumovirus (APV) in turkey and chicken flocks in Germany. First a nested RT-PCR was developed to differentiate between subtype A and subtype B of the APV. For the first PCR two published primers which are located in the conserved region of the G-protein were used. One of them was modified. For the second PCR three primers were developed. Two of them are located in the variable region of the G-protein and do identify subtype A or B. All of the known APV isolates that were tested reacted positive with the nested RT-PCR and the correct subtypes were identified. To confirm the specificity other avian viruses were tested. They showed no amplifications with the developed PCR. The sensitivity of the nested RT-PCR was determined by using RNA extracted from serial 10-fold dilutions of two isolates and two vaccines for each subtype. The dilutions contained a known quantity of the virus. The result is comparable to other published detection limits of PCRs which are used to identify APV. The PCR is not able to differentiate between attenuated virus (vaccine) and virulent virus. To find out, for how long the RT-PCR is able to detect the vaccine virus in tracheal swabs, one day old turkeys were separated into four groups and were kept under experimental conditions. The first group was vaccinated with subtype A (group A), the second with subtype B (group B) and the third with subtype A and B (group A and B). One group was kept as a control (control group). Over five weeks blood and trachealswabs were taken. The RT-PCR is able to detect the vaccine virus for four weeks after a single vaccination with subtype A and for three weeks after a single vaccination with subtype B. Up to the end of the experiment after five weeks the PCR was able to detect APV specific RNA of subtype A after the vaccination with subtype A and B. After two weeks the ELISA-test gives positive results in group A and B, after three weeks in group A and after four weeks in group B, supporting the results of the PCR. The detection rate of APV specific RNA in the testet turkey flocks was 68 percent. The most common subtype at turkey farms in Germany was APV subtype A with 73 percent. Subtype B was detected in 17 percent, subtype A and B in 10 percent of the turkey flocks. With regard to the age of the turkeys the results of the PCR show a higher detection rate of APV specific RNA at the age of 8 to 12 weeks. APV was more often detected in male flocks than in female flocks. Additionally the percentage of subtype A positives was higher in the testet male flocks than in the female flocks.