Fettsäureethylester und Ethylglucuronid als Marker eines chronisch erhöhten Alkoholkonsums

Abstract

Alkoholmissbrauch und die Folgen daraus, wie schwerste gesundheitliche Schäden, Unfälle oder Gewalttaten, stellen ein großes Problem in unserer Gesellschaft dar. Um dem entgegenwirken zu können, ist es notwendig, Marker zur Verfügung zu haben, die es ermöglichen den Alkoholkomsum einer Person objektiv einschätzen zu können. Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zur Bestimmung von Fettsäureethylestern (FSEEs) und Ethylglucuronid (EtG) zum Nachweis eines chronisch exzessiven Alkoholkonsums zu validieren. Bei beiden Markern handelt es sich um Nebenmetabolite aus dem nichtoxidativen Alkoholstoffwechsel. Als Matrizes zum Nachweis von Langzeitalkoholmarkern sind Haare und Mekonium geeignet. Insgesamt wurden Haarproben von 3350 Probanden, sowie Mekoniumproben von 724 verschiedenen Fällen auf Alkoholmarker untersucht. Die Messmethoden zum Nachweis der beiden Marker in Haaren und im Mekonium wurden basierend auf den Vorgaben der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh) validiert. Die Eignung dieser Methoden wurde jeweils an Realproben gezeigt. Die Fettsäureethylesterbestimmung wurde nach Flüssigextraktion der Haare oder des Mekoniums mit Headspace- Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) und anschließender gaschromatographisch- massenspektrometrischer Detektion durchgeführt. Für die Haaranalyse auf FSEEs wurde Linearität für die Arbeitsbereiche von 0,05 ng/mg bis 0,50 ng/mg und von 0,50 ng/mg bis 5,0 ng/mg (je einzelnem FSEE) gezeigt. Aufgrund von Sättigungseffekten bei der HS-SPME mussten getrennte Kalibrierungen für den niedrigen und den hohen Konzentrationsbereich durchgeführt werden. Die Nachweis- (limit of detection = LOD) und Bestimmungsgrenzen (lower limit of quantification = LLOQ) wurden für Ethylmyristat (LOD: 9 pg/mg; LLOQ: 13 pg/mg) Ethylpalmitat (LOD: 9 pg/mg; LLOQ: 19 pg/mg), Ethyloleat (LOD: 14 pg/mg; LLOQ: 31 pg/mg) und Ethylstearat (LOD: 4 pg/mg; LLOQ: 11 pg/mg) bestimmt. Für die Methode zum Nachweis von FSEEs im Mekonium wurde Linearität für einen Arbeitsbereich von 0,05 ng/mg bis 10,0 ng/mg für die einzelnen FSEEs nachgewiesen. Nur für Ethylinolenat lag der Arbeitsbereich zwischen 0,10 ng/mg und 10 ng/mg. Für Ethylmyristat, -palmitat, -linolat und –linolenat war eine Wichtung mit dem Faktor 1/x² erforderlich, für Ethyloleat und –stearat wurde die ungewichtete Kalibrierfunktion verwendet. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden für Ethylmyristat (LOD: 8 pg/mg; LLOQ: 21 pg/mg) Ethylpalmitat (LOD: 7 pg/mg; LLOQ: 17 pg/mg), Ethyloleat (LOD: 6 pg/mg; LLOQ: 19 pg/mg), Ethyllinolat (LOD: 18 pg/mg; LLOQ: 36 pg/mg), Ethyllinolenat (LOD: 13 pg/mg; LLOQ: 44 pg/mg) und Ethylstearat (LOD: 3 pg/mg; LLOQ: 10 pg/mg) bestimmt. Die Ethylglucuronidbestimmung erfolgte nach Flüssigextraktion der Haare oder des Mekoniums mittels Flüssigchromatographie und tandemmassenspektrometrischer Detektion. Für die Haaranalyse wurde Linearität für einen Arbeitsbereich von 7 pg/mg bis 5000 pg/mg und für die Methode zur Ethylglucuronidbestimmung im Mekonium wurde ein linearer Arbeitsbereich von 30 pg/mg bis 80000 pg/mg verwendet. Zur Wichtung der Kalibirerfunktionen wurde jeweils ein Wichtungsfaktor von 1/x² verwendet. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze im Haar lag bei 2 pg/mg beziehungsweise 7 pg/mg. Im Mekonium wurde eine Nachweisgrenze von 10 pg/mg und eine Bestimmungsgrenze von 30 pg/mg ermittelt. In einem zweiten Schritt wurde eine klinische Validierung dieser Marker durchgeführt. Es sollte untersucht werden bei welchen Cut-off-Werten eine bestmögliche Unterscheidung zwischen sozialem und chronisch exzessivem Alkoholkonsum möglich ist. Die Ermittlung geeigneter Entscheidungsgrenzen für Biomarker, die einen pathologischen Prozess oder Befund anzeigen sollen, ist sehr aufwendig. Daten über den Referenzbereich, die Korrelation zwischen Alkoholaufnahme und Markerkonzentration im Haar oder Mekonium, das betrachtete Zeitfenster, Einflussgrößen, die zu einer fehlerhaften Interpretation des Messergebnisses führen können, sowie Daten zu Sensitivität und Spezifität und damit zur Ermittlung eines geeigneten Grenzwertes, können nur auf indirektem Wege gewonnen werden. Die gezielte Aufnahme gesundheitsgefährdender Alkoholmengen kann Testpersonen nicht zugemutet werden. Die Daten wurden somit nur von Realfällen (n = 4074) erhoben. Zuverlässige Angaben zu Trinkgewohnheiten und –mengen, zur Haarkosmetik, zum Gesundheitsstatus allgemein und zu Basisdaten wie Körpergröße, Gewicht, Geschlecht, Haarfarbe etc. sind erforderlich und wurden einbezogen. Für die Haaranalytik wurden sehr weitgehende Aussagen bezüglich der Methodenperformance erhalten und es wurden konkrete Vorschläge zur Optimierung der Entscheidungsgrenzen gemacht. Die Flächen unter den Receiver-Operating-Characteristic-Kurven (ROC curve AUCs) für die Fettsäureethylesterbestimmung im Haar lagen je nach Studiendesign bei 0,745, bei 0,828 bzw. bei 0,955. Für das Ethylglucuronid haben sich abhängig vom Studiendesign ROC curve AUCs von 0,941 bzw. 0,954 ergeben. Die optimierten Entscheidungsgrenzen für die Fettsäureethylesterbestimmung liegen höher als derzeit von der Society of Hair Testing (SoHT) vorgeschlagen. Je nach Fragestellung und je nachdem ob Daten zur Haarkosmetik vorliegen oder diese ausgeschlossen werden kann, sollte ein Grenzwert zwischen 0,70 ng/mg und 1,0 ng/mg für Fettsäureethylester (FSEE) im Haar verwendet werden. Die ermittelten Sensitivitäten lagen zwischen 56 % und 77 % bei Spezifitäten zwischen 80 % und 96 %. Für das Ethylglucuronid (EtG) wurden optimierte Grenzwerte von 28 bzw. 30 pg/mg errechnet, was dem von der Society of Hair Testing vorgeschlagenen Cut-off (30 pg/mg) entspricht. Die berechneten Sensitivitäten lagen je nach Studiendesign zwischen 75 % und 83 % mit Spezifitäten von jeweils 97 %. Die Untersuchungsergebnisse legen nahe, dass das Ethylglucuronid besser zum Nachweis eines chronisch exzessiven Alkoholkonsums geeignet ist als die Fettsäureethylester. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die kombinierte Interpretation beider Marker dazu führt, dass besonders wenig falsch positive und falsch negative Befunde erhalten werden. Außerdem wurden FSEE und EtG im Haar mit den traditionell aus dem Blut bestimmten Alkoholmarkern Desialotransferrin (engl.: Carbohydrate deficient transferrin (CDT)), Gammaglutamyltransferase (GGT), mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (engl.: mean corpuscular volume (MCV)), Aspartataminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Haaranalyse auf direkte Alkoholmarker den klassischen Markern und Methoden überlegen ist. Dies liegt an den größeren Nachweiszeitfenstern und der höheren Sensitivität und Spezifität. Lediglich bei viele Monate andauerndem fortgesetzten Alkoholabusus, Ausschluss von nicht alkoholbedingten Lebererkrankungen und einem maximal 2-3 Wochen zurückliegenden Abstinenzbeginn, sind CDT und GGT mit ROC curve AUCs von 0,899 bzw. 0,943 vielfach die wirtschaftlicheren Alternativen mit vergleichbarer Aussagekraft. Für die Anwendung bei besonderen Fragestellungen wie Workplace Drug Testing (n = 78), familienrechtlichen Fragestellungen und bei Todesfällen (n = 1057) wurden Daten gesammelt und die Eignung der Methodik beschrieben. Für die Bestimmung von Ethylglucuronid und Fettsäureethylestern im Mekonium wurde neben den analytischen Methodenvalidierungen eine Baselinestudie zur Abschätzung des Referenzbereiches durchgeführt, in der für eine große Population (n = 602) Alkoholmarkerkonzentrationen im Mekonium bestimmt wurden, um so „Normalwerte“ zu erhalten. Eine sichere Entscheidungsgrenze konnte so zwar nicht ermittelt werden, jedoch konnte ein Referenzbereich grob abgegrenzt werden. Für die Fettsäureethylester ist ein Cut-off bei 0,50 ng/mg und für das Ethylglucuronid von 274 pg/mg als geeignet abgeschätzt worden. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit bestätigt werden, dass Ethylglucuronid und Fettsäureethylester als Marker eines chronisch erhöhten Alkoholkonsums geeignet sind.

Alcohol abuse and its consequences such as severe illnesses, accidents or violence are major problems in western societies. Therefore, reliable and accurate biomarkers are required to objectively monitor alcohol consumption. The aim of this research project was to validate analytical methods for the determination of fatty acid ethyl esters (FAEEs) and ethyl glucuronide (EtG) as long term alcohol abuse markers. Both markers are minor metabolites which are released during non-oxidative alcohol metabolism. Hair and meconium were identified as suitable analytical matrices that provide a large time frame. Hair samples from 3350 test persons and meconium samples from 724 cases were analyzed in total. Methods to detect these markers in hair and meconium were validated according to the guidelines of the German Society of Forensic Toxicologists (GTFCh). The applicability of these methods was demonstrated in real cases. Liquid extraction from hair or meconium was performed to determine the FAEEs. This was followed by headspace solid phase microextraction (HS- SPME) and gaschromatography mass spectrometry. Linearity was shown for the calibration ranges from 0.05 ng/mg to 0.50 ng/mg (for the single FAEEs) and from 0.50 ng/mg up to 5.0 ng/mg. A high range and a low range calibration were applied because the calibration curve was slightly bent due to saturation effects. The limits of detection (LODs) and the lower limits of quantification (LLOQ) were estimated for ethyl myristate (LOD: 9 pg/mg; LLOQ: 13 pg/mg), ethyl palmitate (LOD: 9 pg/mg; LLOQ: 19 pg/mg), ethyl oleate (LOD: 14 pg/mg; LLOQ: 31 pg/mg) and ethyl stearate (LOD: 4 pg/mg; LLOQ: 11 pg/mg). The method used to quantify FAEEs in meconium showed linearity for the calibration range from 0.05 ng/mg to 10.0 ng/mg (for the single FAEEs). A calibration range from 0.10 ng/mg to 10.0 ng/mg was applied only to ethyl linolenate. The curves of ethyl myristate, ethyl palmitate, ethyl linoleate and ethyl linolenate were weighted using a factor of 1/x²; weighting was not nessecary for ethyl oleate and ethyl stearate. The limits of detection and the lower limits of quantification were estimated for ethyl myristate (LOD: 8 pg/mg; LLOQ: 21 pg/mg), ethyl palmitate (LOD: 7 pg/mg; LLOQ: 17 pg/mg), ethyl oleate (LOD: 6 pg/mg; LLOQ: 19 pg/mg), ethyl linoleate (LOD: 18 pg/mg; LLOQ: 36 pg/mg), ethyl linolenate (LOD: 13 pg/mg; LLOQ: 44 pg/mg) and ethyl stearate (LOD: 3 pg/mg; LLOQ: 10 pg/mg). Following liquid extraction from hair or meconium, ethyl glucuronide was measured using liquid chromatography tandem mass spectrometry. A linear calibration ranging from 7 pg/mg up to 5000 pg/mg was applied in the detection of EtG in hair. A linear calibration curve from 30 pg/mg to 80000 pg/mg was used in order to quantify EtG in meconium. The calibration functions were weighted with the factor 1/x². The LOD and LLOQ in hair were 2 pg/mg and 7 pg/mg, respectively. In meconium, a LOD of 10 pg/mg and a LLOQ of 30 pg/mg were estimated. In addition to the analytical validation a clinical validation of these markers and their performances were considered important. Reliable cut-off values for the differentiation between social drinking and chronic excessive drinking should be investigated. The estimation of suitable reference ranges and cut-offs for biomarkers, used for the detection of pathological processes, is difficult. Data on reference ranges, the correlation between alcohol intake and marker concentration in hair or meconium, the covered time frame, influence values which may lead to a misinterpretation as well as data on sensitivity and specificity can only be generated indirectly. Test persons cannot participate in studies which include the systematic intake of harmful amounts of alcohol. Therefore, the data was generated from real cases (n = 4074). Reliable information on drinking habits, drinking amounts, hair cosmetics, the general health status and general parameters such as body weight, height, gender and hair color were necessarily considered. Extensive investigations on the hair test for alcohol markers were conducted and detailed results regarding method performances as well as a suggestion for optimized cut-offs were obtained. The areas under the Receiver Operating Characteristic curves (ROC curve AUCs) in the determination of FAEEs in hair were, according to the study design, 0.745, 0.828 and 0.955. For ethyl glucuronide in hair, ROC curve AUCs of 0.941 and 0.954 respectively were recorded. The cut-off values for FAEEs optimized according to the presented data were higher than the actual cut-offs proposed by the Society of Hair Testing (SoHT). Depending on the population and depending on the availability of data on hair cosmetic treatment the cut-off should be raised to a value between 0.70 ng/mg and 1.00 ng/mg. The sensitivities were estimated between 56 % and 77 % with specificities between 80 % and 96 %. The optimized cut-off values for EtG were calculated as 28 pg/mg or 30 pg/mg respectively, which is in accordance with the proposal of the SoHT. Depending on the study design the sensitivities were between 75 % and 83 % with a specificity of 97 % in both cases. The results of the presented studies indicate that ethyl glucuronide in hair is a better marker for detecting alcohol abuse when compared to FAEEs in hair. Nevertheless, it was demonstrated that the combined interpretation of both markers leads to a decreased number of false-positive and false-negative results. In addition, hair FAEEs and hair EtG were compared to the traditional alcohol markers carbohydrate deficient transferring (CDT), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), mean corpuscular volume of the erythrocytes (MCV), aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase (ALT) which are measured using blood samples. In general, it was found that the hair analysis was more accurate than the traditional alcohol markers. Main advantages were the wider time frame that was covered, especially when EtG and FAEEs are interpreted in combination, a higher sensitivity and specificity was reported. However, markers such as CDT and GGT may be more cost-effective in some cases. Their values rose only after long-term alcohol abuse when significant organ damages became apparent and in most cases receded to their reference range within 2 or 3 weeks of alcohol abstinence. The application of hair analysis of alcohol markers for a variety of situations, such as workplace drug testing, driving ability examination, death cases and family courts was tested and pitfalls and advantages were described. Methods for the detection of ethyl glucuronide and fatty acid ethyl esters in meconium were validated according to forensic guidelines. A baseline study including 602 cases was undertaken to estimate a reference range for the alcohol marker concentrations and for this population the alcohol marker concentration in meconium was measured to estimate a “normal” value. A confident cut-off value could not be obtained, but, as a first step, a reference range was roughly estimated. A cut-off of 0.50 ng/mg for FAEEs and 274 pg/mg for EtG was applied. In conclusion, the results of this work demonstrate and confirm the applicability of ethyl glucuronide and fatty acid ethyl esters as long-term alcohol abuse markers.