Quantifizierung der ABCB1-mRNA in Lymphozytensubpopulationen: die Rolle genetischer Polymorphismen im ABCB1-Gen

Abstract

P-Glykoprotein (P-Gp) ist ein membranständiges Protein, das als Efflux- Transporter die intrazelluläre Konzentration seines Substrats vermindert. Seine physiologische Funktion liegt im Schutz der Zelle vor schädigenden Substanzen sowie der Elimination endogener Stoffwechselprodukte. P-Gp spielt eine wichtige Rolle in der zellvermittelten Immunität sowie bei der Multiplen Wirkstoffresistenz und ist von zentraler Bedeutung für die Pharmakokinetik zahlreicher therapeutisch wichtiger Wirkstoffe. Beim Menschen wird P-Gp durch das ABCB1-Gen kodiert. Für dieses Gen ließen sich genetische Polymorphismen identifizieren, denen eine Auswirkung auf die Expression von ABCB1 und somit auf die Aktivität von P-Gp zugeschrieben wird. Untersuchungen zu dieser Frage kommen zu teilweise konträren Ergebnissen. Im Rahmen einiger Studien findet ein kleinerer Medikamententransporter Mini-P-Gp Erwähnung, der mutmaßlich durch einen alternativen Spleißvorgang an der ABCB1-RNA entsteht. Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob sich die Expression von P-Gp, abgebildet in ABCB1-mRNA-Mengen, in vier Zelllinien der peripheren lymphatischen Blutreihe (CD4+-, CD8+-, CD56+- und CD 19+-Lymphozyten) unterscheidet. Außerdem sollte geklärt werden, ob die Höhe der P-Gp-Expression mit dem Vorhandensein bestimmter Genotypen zweier häufiger genetischer Polymorphismen im ABCB1-Gen (G2677T/A und C3435T) assoziiert ist. Durch die Auswahl spezifischer Primer zur Vervielfältigung der N- bzw. C-terminalen Hälfte des ABCB1-Gens erfolgte die Überprüfung der Existenz von Mini-P-Gp. Die Trennung der von uns untersuchten Zelllinien geschah durch FACS-Zellsortierung nach Färbung mit immunfluoreszierenden Antikörpern. Mit Hilfe eines quantitativen RT-PCR- Versuchsaufbaus wurde die ABCB1-mRNA gemessen. Zur Normalisierung der gemessenen Konzentrationen diente die gleichzeitige Quantifizierung eines Housekeeping-Gens. Die Ergebnisse unserer Studie wiesen die höchste ABCB1 -mRNA-Menge in CD 56+-, gefolgt von CD8+-, CD4+- und CD 19+-Lymphozyten nach. Dies steht in Einklang mit früheren Studien zur Aktivität des Medikamententransporters und unterstreicht die physiologische Rolle von P-Gp in der zellvermittelten zytotoxischen Immunität. Bei der Überprüfung der genetischen Polymorphismen hinsichtlich der Expression von P-Gp konnte nach Normalisierung der Daten keine statistisch signifikante Auswirkung auf die Anzahl der ABCB1-mRNA-Kopien in allen Zellpopulationen gefunden werden. Die Frage nach der Existenz eines Mini-P-Gp konnte nicht geklärt werden. Zwar wurde in allen Zellen eine etwa halb so hohe Transkriptzahl für die N-terminale Hälfte wie für die C-terminale Hälfte gemessen, was als Indiz für die Existenz des kleineren Transporterproteins gewertet werden kann. Doch darf dabei nicht außer Acht gelassen werden, dass die Effizienz der PCR für die N-terminale Hälfte schlechter als für die C-terminale Hälfte ist. Außerdem gibt es bisher keine molekularen Analysen, die das Phänomen Mini-P-Gp erklären könnten.

P-Glycoprotein (P-Gp) is a membrane-bound protein, which acts as an efflux- pump and reduces the intracellular concentration of its substrates. Its physiological function is the protection of the cell from toxic substances as well as the elimination of endogenous metabolic wastes. P-Gp plays an important role in cell-mediated immunity, in multi-drug resistance and in the phamacokinetics of numerous therapeutic agents. In humans P-Gp is encoded by the ABCB1-gene. A number of genetic polymorphisms for this gene have been identified, which may have implications on the expression of ABCB1 and, consequently, on the activity of P-Gp. Investigations in this field have resulted in contradictory findings. In some studies a small drug transporter, Mini-P-Gp, is mentioned, which may be the result of alternative splicing of the ABCB1-RNA. The objective of this study was to find out, whether the expression of P-Gp, as measured in ABCB1-mRNA, differs in 4 lines of the peripheral blood lymphoid cell pool (CD4+-, CD8+-, CD 56+- and CD19+-lymphocytes) and whether the amount of P-Gp expression is associated with two frequent genetic polymorphisms in the ABCB1-gene (G2677T/A and C3435T). By designing specific primers for the amplification of the N- and C-terminal half of the ABCB1-gene, respectively, we tried to verify the existence of Mini-P-Gp. Cell separation was carried out using FACS cell- sorting after staining with fluorescent antibodies. Quantification was performed with a quantitative RT-PCR assay. The results were normalised by simultaneous quantification of a housekeeping-gene. We found the highest amount of ABCB1-mRNA in CD56+, followed by CD8+-, CD4+,- and CD19+- lymphocytes. This is in accordance with previous studies on the activity of the drug transporter and underlines its physiological role in cell-mediated, cytotoxic immunity. However, no statistically significant effect on the ABCB1 -mRNA-copy number as a result of the different genetic polymorphisms could be seen after normalising the data. The question of the existence of Mini-P-Gp could not be clarified. We found approximately half as many transcript copies of the N-terminal half as of the C-terminal half in all cell lines, which could be an indicator of the existence of the smaller transport protein. However, this result may be confounded by a lower PCR efficiency for the N-terminal half than for the C-terminal half. Moreover, there is to this date no molecular analysis explaining the phenomenon Mini-P-Gp.