Evaluation of the protozoan parasite L. tarentolae as a eukaryotic expression host in biomedical research

Abstract

Leishmania tarentolae is a eukaryotic, protozoan parasite of the genus Leishmania. It is transmitted by sand flies and infects only reptiles. It was originally isolated in 1921 and is one of the best studied Leishmania species today. In addition to the research of human leishmaniasis, a strongly growing application area of this parasite in the last years is recombinant protein expression. The increasing use as an expression host is mainly based on its ability to synthetize human recombinant proteins not only in biologically active form, but also providing them with posttranslational modifications of high homogeneity. The quality of expressed proteins could be sufficient in principle to e.g. use them as therapeutic agents in biomedical research. However, this statement is based on little knowledge from very few analysed examples, questioning their possible biomedical application. Hence, the main goal of my work was to evaluate the potential of the L. tarentolae expression system for biomedical research and the suitability of recombinant proteins as human therapeutic agents, respectively. Therefore, successfully established culture conditions as well as different expression vector variants will form a solid initial situation. The most frequently approved recombinant therapeutic proteins are monoclonal antibodies, proteins with enzymatic activity or generally glycosylated proteins. Their successful expression in L. tarentolae would confirm the biomedical potential of the parasitic expression system and therefore the main goal of my work. Here, glycoproteins play a major role as more than 50% of all human proteins are glycosylated. During the secretory process, glycoproteins are glycosylated and are finally incorporated into the cell membrane or are secreted into the extracellular space/culture supernatant. For this, proteins need a secretory signal peptide, whose amino- acid sequence strongly influences expression-secretion efficiency of the protein. To maximize the yield of secretory proteins, the secretory signal peptide of the acid phosphatase 1 (sAP1) of L. mexicana was modified in my work, and the expression-secretion efficiency was tested with recombinant human antibody fragments (scFv’s). In the end, the protein yield could be increased close to an order of magnitude (Manuscript 1). Based on these results, the human glycoprotein ‘soluble amyloid precursor protein alpha’ (sAPPalpha) was selected as a next example, and cloned together with the optimized signal peptide of manuscript I. Again, the secreted protein could be produced in a biologically active form with sufficient quantities. Mass spectrometric analyses of sAPPalpha could show for the first time, that L. tarentolae is not only able to provide a human recombinant glycoprotein with N glycosylations, but also with O-glycosylations (Manuscript 2). In addition, other studies could demonstrate, that the glycosylation profile of human proteins expressed in L. tarentolae shows, compared to other eukaryotic expression systems (yeast, insect cells, or plant cell culture), the highest homogeneity to the human original. These results support the application of human glycoproteins as therapeutic agents expressed with L. tarentolae. Beside secretory proteins, intracellularly accumulating proteins were also expressed in my work. Due to the interaction with endogenous biomolecules, the choice of the right purification strategy is most important to get a product of high purity. For this, a new L. tarentolae strain was generated. By constitutive expression of the biotin ligase of E. coli, this strain is now able to biotinylate co-expressed proteins in a sequence-specific manner. Biotinylation is a relatively rare posttranslational protein modification, where the biotin ligase is only linking a biotin sequence-specific to proteins offering a biotin-acceptor peptide-sequence. Here, I could show minimal off-target effects of the enzyme. On the one hand, biotinylation is used to confirm successful protein purification. On the other hand, biotin itself can be used for purification. In my work, all intracellularly expressed proteins were purified via a poly-histidine-tag. Moreover, I could also show that intracellular accumulating human proteins can be functionally expressed in L. tarentolae. As example, human p53 could also trigger autophagy in L. tarentolae (Manuscript 4). For functionality, p53 needs to be properly phosphorylated, which was not shown here due to the lack of specific antibodies. In conclusion, my results demonstrate that L. tarentolae is well- suited for the production of recombinant proteins of highest quality. In addition, mammalian-like glycosylation profiles of human recombinant proteins indicate that L. tarentolae can be utilized as an alternative expression system to cell culture systems like CHO-cells (Chinese Hamster Ovary cells). Concluding, L. tarentolae is in the future also eligible for the production of human therapeutically applicable proteins.

Leishmania tarentolae ist ein einzelliger, eukaryotischer Parasit, welcher zur Gattung der Leishmanien gehört. Er wird von Sandmücken übertragen und infiziert – im Gegensatz zu seinen humanpathogenen Verwandten – keine Menschen, sondern ausschließlich Reptilien. Er wurde 1921 erstmals isoliert und gehört heute zu den am besten untersuchten Leishmania Arten. Neben der Erforschung der humanen Leishmaniose, wird er vor allem in den letzten Jahren verstärkt für die rekombinante Proteinexpression eingesetzt. Die zunehmende Verwendung als Expressionswirt beruht hauptsächlich auf seiner Fähigkeit, humane rekombinante Proteine nicht nur in biologisch aktiver Form zu synthetisieren, sondern auch mit posttranslationalen Modifikationen hoher Homogenität auszustatten. Die Qualität der hier entstehenden Proteine könnte prinzipiell ausreichen, um sie z.B. als Therapeutikum in der biomedizinischen Forschung einzusetzen. Jedoch fußt diese Aussage auf nur wenigen Erkenntnissen aus sehr wenigen analysierten Beispielen, sodass ihr möglicher biomedizinischer Einsatz nicht eindeutig gesichert ist. Das Hauptziel meiner Arbeit bestand folglich darin, das Potential des Expressionssystems von L. tarentolae für die biomedizinische Forschung bzw. seine Eignung zur Herstellung rekombinanter Proteine als potentielle humane Therapeutika weiter zu evaluieren. Sowohl erfolgreich etablierte Kultivierungsbedingungen, als auch unterschiedliche Expressionsvektoren bilden hierfür eine solide Ausgangssituation. Die am häufigsten zugelassenen rekombinanten Proteintherapeutika sind monoklonale Antikörper, Proteine mit enzymatischer Aktivität oder generell glykosylierte Proteine. Ihre erfolgreiche Expression in L. tarentolae wäre demnach eine Bestätigung des biomedizinischen Potentials des Expressionssystems und somit das Hauptziel meiner Arbeit. Glykoproteine spielen hier eine übergeordnete Rolle, da mehr als 50% aller menschlichen Proteine glykosyliert sind. Sie erhalten während des sekretorischen Prozesses ihre Glykosylierung und werden letztlich entweder in die Zellmembran inkorporiert, oder aber von der Zelle in den extrazellulären Raum/Kulturüberstand sezerniert. Hierfür benötigen die Proteine ein sekretorisches Signalpeptid, dessen Aminosäure-Abfolge in starker Weise die Expressions-Sekretions-Effizienz des Proteins beeinflusst. Um folglich die Ausbeute sezernierter Proteine zu maximieren, wurde in dieser Arbeit das sekretorische Signalpeptid der sauren Phosphatase 1 (sAP1) aus L. mexicana modifiziert, und die Expressions-Sekretions-Effizienz mit Antikörper- Fragmenten (scFv’s) getestet. Hierbei konnte eine Erhöhung der Proteinausbeute um nahezu eine Potenz erzielt werden (Manuskript 1). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde das humane Glykoprotein ‚soluble amyloid precursor protein alpha‘ (sAPPalpha) als weiteres Beispiel ausgewählt, und mit dem optimierten Signalpeptid kloniert. Auch hier konnte das sezernierte Protein funktionell und in ausreichenden Mengen produziert werden. Anhand von sAPPalpha konnte zum ersten Mal mit diesem Teil der Arbeit gezeigt werden, das L. tarentolae nicht nur in der Lage ist ein humanes rekombinantes Glykoprotein mit N-Glykosylierungen, sondern ebenfalls mit O-Glykosylierungen auszustatten (Manuskript 2). Andere Studien konnten außerdem zeigen, dass das Glykosilierungsprofil von in L. tarentolae exprimierten humanen Proteinen im Vergleich zu anderen eukaryotischen Expressionssystemen (Hefen, Insektenzellen, oder pflanzlichen Zellkulturen) sogar die höchste Homogenität zum humanen Original aufwies. Diese Ergebnisse sprechen sehr stark dafür, L. tarentolae für die Expression humaner Glykoproteine als Therapeutika einzusetzen. Neben sekretorischen Proteinen, habe ich in meiner Arbeit auch intrazellulär akkumulierende Proteine exprimiert. Aufgrund der Interaktion mit endogenen Biomolekülen, ist hier die Wahl der richtigen Aufreinigungsstrategie besonders wichtig, um am Ende ein Produkt von hoher Reinheit zu bekommen. Dazu wurde ein neuer L. tarentolae Stamm generiert, der durch die konstitutive Expression der Biotin-Ligase aus E. coli nun in der Lage ist, ko-exprimierte Proteine zu biotinylieren. Biotinylierung an sich ist eine seltene posttranslationale Proteinmodifizierung, bei der die Biotin-Ligase Biotin sequenzspezifisch an Proteine koppelt, die eine Biotin-Akzeptor Peptidsequenz besitzen. Hier konnte ich zeigen, dass es nur wenige Nebeneffekte des Enzyms gibt. Die Biotinylierung dient zum einen als Nachweis der erfolgreichen Proteinaufreinigung, zum anderen kann man über Biotin selbst aufreinigen. Hier wurden die Proteine jedoch über einen Polyhistidin-tag aufgereinigt. Weiterhin konnte ich zeigen, dass auch intrazellulär akkumulierende humane Proteine in Leishmania in funktioneller Form exprimiert werden können. So konnte humanes p53 auch in L. tarentolae Autophagie auslösen (Manuskript 4). Dies setzt u.a. die funktionelle posttranslationale Modifikation – hier die Phosphorylierung – des p53 voraus, welches jedoch hier Mangels spezifischer Antikörper nicht gezeigt werden konnte. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass L. tarentolae für die Produktion von rekombinanten Proteinen höchster Qualität anwendbar ist. Durch das säugetierähnliche Glykosilierungsprofil von humanen rekombinanten Proteinen kann er zudem als alternatives Expressionssystem zu Zellkultursystemen wie CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) eingesetzt werden. Somit kann man schlussfolgern, dass L. tarentolae in Zukunft auch für die Herstellung für am Menschen therapeutisch anwendbarer Proteine durchaus in Frage kommen kann.