Transcriptome-wide Single-cell Analysis of Human Macrophage Heterogeneity

Abstract

Phenotypic and functional flexibility is a key feature of immune cells such as macrophages, instrumental to their functions in pathogen defense and to maintain homeostasis. Traditional population average measurements have been widely applied to characterize macrophage diversity. But population average measurements obscure the underlying single-cell heterogeneity, and thus hinder an unbiased characterization of cellular response to external stimulation. Analyzing isogenic human THP-1 macrophages and primary human macrophages by single-cell RNA sequencing, we investigated cellular heterogeneity in the context of early innate activation, using lipopolysaccharide (LPS) as a defined stimulus. For resting and in particular for activated macrophages, significant differences in expression of central immune genes was observed in three macrophage states with pro-inflammatory (M1-like), anti-inflammatory (M2-like) and low-response homeostasis-preserving (M0-like) characteristics. Results from RNA-fluorescence in situ hybridization assays for selected transcripts suggest different morphological phenotypes for pro-inflammatory and anti-inflammatory macrophages. Macrophages flexibly switch between these phenotypes over time or shift towards one phenotype upon stimulations. Moreover, identified state-specific hub genes for pro- and anti-inflammatory cells, including hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and glucocorticoid receptor (GR), respectively, revealed digital all-or-none gene expression response to potentially govern macrophage state balance. Notably, observed cellular states featured differential responsiveness and signaling dynamics after stimulation. While low-response cells showed promiscuous signaling, the pro- and the anti-inflammatory cells showed high response and lower signaling entropy. Titration experiments suggest, that low-response macrophages act as a reservoir to allow transitions into pro- or anti-inflammatory cells under increasing doses of applied stimuli. In summary, the here shown analyses indicate cellular mechanisms to respond efficiently to external stimulation, by inducing cell state specific expression of genes. Holistic, single-cell based characterization of macrophage states might serve as a new framework to advance our understanding of cellular heterogeneity in general and for future research to explore mechanisms of physiological resilience in health and disease.

Funktionelle Flexibilität ist eine entscheidende Eigenschaft von Makrophagen, um Krankheitserreger bekämpfen zu können und gleichzeitig Homöostase aufrechtzuerhalten. Um die damit einhergehende Diversität von Makrophagen mittels Transkriptom-Analysen zu messen, wurden bisher überwiegend Methoden eingesetzt, die keinen Rückschluss auf die Identität einzelner Zellen zulassen. Dies erschwert die unverfälschte Charakterisierung der tatsächlichen, heterogenen Makrophagenantwort. In dieser Arbeit wurden Sequenzierungsverfahren eingesetzt, welche die genomweite Analyse von Transkriptomen einzelner Zellen ermöglichen. Hierbei wurden humane THP-1 Makrophagen sowie primäre humane Makrophagen, die mit Lipopolysacchariden (LPS) behandelt wurden, als Modellsystem genutzt. Die Behandlung mit LPS dient als Stimulus, um die angeborene Immunantwort bei Makrophagen auszulösen und schließlich zu untersuchen. Bei stimulierten Makrophagen, und im schwächeren Ausmaß bei unbehandelten Zellen, wurden drei unterscheidbare Makrophagenpopulationen ermittelt. Diese Subpopulationen wiesen divergente Genaktivitäten auf, die sich mit der etablierten Einteilung von Makrophagen vergleichen ließen: Proinflammatorische M1-Makrophagen, antiinflammatorische M2-Makrophagen und kaum reagierende, homöostatische, M0-Makrophagen. Mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) konnte anhand ausgewählter Gene gezeigt werde, dass proinflammatorische und antiinflammatorische Makrophagen distinkte morphologische Phänotypen haben, zwischen denen sie, im zeitlichen Verlauf, flexibel wechseln können. Durch integrative Analysen konnten zentrale, regulatorische Gene ermittelt werden, die für proinflammatorische oder antiinflammatorische Makrophagen spezifisch sind. Die Expression dieser Gene und deren Proteine (z.B. Hypoxie-induzierter Faktor 1 (HIF1) und Glukokortikoid-Rezeptor (GR)) hatten binären Charakter und trat im wechselseitigen Ausschluss in unterschiedlichen Zellen auf. Die Fähigkeit der Makrophagenpopulationen auf Signale zu reagieren war stark unterschiedlich. Proinflammatorische und antiinflammatorische Makrophagen zeigten starke Reaktionen gegenüber externen Signalen. Homöostatische Makrophagen wiesen hingegen eine sehr schwache Immunantwort auf. Experimente unter Applikation erhöhter Stimulierung, deuteten darauf hin, dass homöostatische Makrophagen als Reservoir für eine Umwandelung in Proinflammatorische oder antiinflammatorische Zellen dienen. Die hier durchgeführten Analysen weisen auf Mechanismen hin, welche die effektive Immunantwort von Makrophagen, durch ihre inhärente Heterogenität ermöglichen.