Kernspinresonanzspektroskopie an Molekularen Maschinen mit Hilfe der Dynamischen Kernpolarisation

Abstract

Die dynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, die Sensitivität der Kern-Magnetresonanz-Spektroskopie (NMR-Spektroskopie) um zwei bis drei Größenordnungen zu steigern. Grundlage der DNP ist der Transfer der relativ starken Polarisation ungepaarter Elektronen auf benachbarte Atomkerne. Eine erfolgreiche Implementierung dieser Technik in das Standard-Repertoire der Festkörper-NMR würde zu einem enormen Fortschritt in der Strukturbiologie führen. So sollte es beispielsweise möglich sein, Peptide und Proteine in ihrer nativen Umgebung zu untersuchen. Um die DNP effektiv nutzen zu können, müssen jedoch mindestens zwei grundlegende Bedingungen erfüllt sein: Das Vorhandensein ausreichender Mengen freier Elektronen (bzw. Radikalen) in der Probe sowie ein Absenken der Probentemperatur auf unter 100 K. Beide Bedingungen können jedoch zu einer signifikanten Signalverbreiterung führen und so die Interpretation der aufgezeichneten Spektren im Sinne der Strukturaufklärung erschweren. Ein Ziel dieser Arbeit war daher, zunächst den Einfluss des derzeit am häufigsten verwendeten Biradikals (TOTAPOL) auf die NMR-Signale zu untersuchen (Abschnitt 3.1). In weiteren Versuchen wurde der Einfluss tiefer Probentemperaturen auf die NMR-Signale untersucht (Abschnitt 3.2).Abschließend wurde mittels DNP-verstärkter Festkörper-NMR der Faltungszustand naszierender Ketten innerhalb stabil arretierter Ribosomen untersucht (Abschnitt 3.3). Bei dieser molekularen Maschine limitiert die Größe der Ribosomen wesentlich die Analyt-Konzentration und erschwert zudem die selektive Detektion von NMR-Signalen der naszierenden Kette. Unter Verwendung der DNP und eines Doppelquantenfilters war es dennoch möglich, Signale zu detektieren welche eindeutig und ausschließlich der naszierenden Kette zugeordnet werden können. Eine Zuordnung von einzelnen Signalen zu bestimmten Seitenketten wurde dabei auf Grundlage von Punktmutationen durchgeführt. Diese zugeordneten Signale wurden anschließend verwendet, um den Faltungszustand der naszierenden Kette zu analysieren. Dazu wurden in erster Linie sekundäre Chemische Verschiebungen von Serin-Signalen ermittelt und mit statistischen Werten verglichen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass bereits mit den heute zur Verfügung stehenden DNP-Spektrometern und Biradikalen gut aufgelöste Spektren von Proteinen in einer weitgehend nativen Umgebung aufgezeichnet werden können. Entscheidend bei der Durchführung der DNP- Experimente sind dabei sowohl die Wahl einer geeigneten Biradikal- Konzentration als auch eine optimale Proben-Präparation. Es konnte gezeigt werden, dass die Auflösung und damit die Interpretierbarkeit der aufgezeichneten Spektren, im Wesentlichen durch die Veränderung der Dynamik einzelner Seitenketten bei tiefen Temperaturen bestimmt wird. Biradikale, welche eine langsame Elektronenrelaxation aufweisen, könnten einen effektiven Polarisationstransfer bei hohen Temperaturen ermöglichen und so die Bedeutung der DNP in der NMR-gestützten Strukturforschung maßgeblich steigern.

Solid state nuclear magnetic resonance (ssNMR) enables the analysis of protein structures and dynamics on an atomic scale. With this method, it is possible to investigate proteins which are difficult to crystallize as well as large monomeric or heteromeric complexes. Therefore, solid state NMR is an indispensable method for structural biology. The low intrinsic sensitivity of ssNMR method can be overcome through dynamic nuclear polarization (DNP). This opens new possibilities to analyze molecular machines within their native environment. The current implementation of DNP in the solid state requires addition of radicals or biradicals, and cryogenic sample temperatures. These prerequisites can lead to significantly broadened signals and, therefore, to a reduced spectral resolution. The range of viable systems which can be investigated by DNP is thus limited. The aim of this work is to analyze the cause and extent of the broadening effects of both the biradical dopant and the cryogenic temperatures. These studies should indicate ways way to reduce the negative effects in order to exploit the potential of DNP. In the first part the influence of the biradical concentration on proline solutions were investigated (section 3.1). In the second part of this work the influence of low temperatures on the spectral resolution of SH3 spectra is investigated (section 3.2 Finally, the folding state of stable arrested nascent chains that are contained in then ribosome exit tunnel were investigated by DNP enhanced ssNMR. The size of the ribosome limits the analyte concentration, making the detection of nascent chain specific resonances a challenging task. We approached this challenge by implementing double quantum filtering into two- dimensional carbon correlation spectroscopy. The introduction of serine-to- alanine substitutions within the nascent chain enabled us to exploit the advantage of the unique chemical shift properties of the serine aliphatic resonances. Furthermore, the nascent chain contains four serines, each two serines within the N-terminal and the C-terminal half. Therefore, two double mutants were expressed in which serines appear ether exclusively in the N-terminal or C-terminal half of the nascent chain. Comparison of the two double mutants revealed slight differences in the respective serine resonances. According to available statistical datasets, these slight differences can be addressed to a different structural context of the respective serine residues. Nevertheless, a final clear assessment of the folding state of the nascent chain is still pending. But, it was demonstrated that higher magnetic fields will lead to more resolved resonances. Thus, recent developments in the microwave sources and superconducting magnets will lead to an improvement of the spectral quality and enable a non-ambiguous analysis of the folding state. In summary, with currently available techniques, it is possible to obtain sufficiently well resolved spectra of proteins in their native environments. The investigation of ligand-receptor systems are significantly improved using DNP if additional line broadening can be prevented. In this respect choosing the right biradical concentration and sample preparation method is a crucial p